Articles

SERPINA1 mRNA jako Léčba Alfa-1-Antitrypsinu

Abstrakt

Alpha-1-antitrypsin (AAT) nedostatek je genetická porucha, která produkuje neaktivní/vadný AAT v důsledku mutace v genu SERPINA1 gen kódující AAT. Toto onemocnění je spojeno se sníženou aktivitou AAT v plicích a ukládáním nadměrného defektního proteinu AAT v játrech. V současné době neexistuje žádná specifická léčba onemocnění jater spojená s nedostatkem AAT. Plicní onemocnění AAT je často léčeno jedním z několika produktů nahrazujících sérové proteiny; dlouhodobé studie účinnosti substituční terapie SerpinA1 však nejsou k dispozici a nesnižují poškození jater při nedostatku AAT. léčba mRNA by mohla potenciálně cílit jak na játra, tak na plíce pacientů s deficitem AAT. Fibroblasty pacientů s AAT a hepatocyty odvozené od AAT pacientů s fibroblasty byly transfektovány mRNA kódující serpina1 a média buněčné kultury byla testována na expresi SerpinA1. Naše data prokazují zvýšený protein SerpinA1 v kultivačním médiu z léčených fibroblastů pacientů AAT a hepatocytů odvozených od fibroblastů pacientů AAT. In vivo studie na volně žijících typ myši prokázat SERPINA1 mRNA biodistribuce v játrech a plicích, stejně jako SerpinA1 exprese proteinů v těchto dvou cílových orgánů, které jsou kriticky ovlivněna deficitem AAT. Společně naše údaje naznačují, že léčba mRNA SerpinA1 má potenciál prospět pacientům trpícím nedostatkem AAT.

1. Úvod

nedostatek alfa-1-antitrypsinu (aatd) je devastující onemocnění s nedostatkem adekvátní terapie. Současné terapie chrání pouze plíce a v pokročilých případech vyžadují časté intravenózní injekce plazmatického proteinu AAT. U pacientů s AATD jsou náchylní k obstrukční plicní nemoci a onemocnění jater (např. cirhóza a hepatocelulární karcinom u dětí a dospělých) . Odhaduje se, že přibližně 1-5% pacientů s diagnostikovanou chronickou obstrukční plicní nemocí (CHOPN) má nedostatek alfa-1-antitrypsinu . I když je extrémně vzácný, byl hlášen emfyzém u dětí s AATD a výskyt onemocnění jater se s věkem zvyšuje . Závažné příznaky se objevují později v životě, zejména u kuřáků. Jaterní příznaky AATD jsou pozorovány pozdě v životě a často vyžadují transplantaci jater. AATD je dědičné onemocnění způsobené mutacemi v genu SERPINA1 . Gen SERPINA1 má dvě alely označené jako M alely (normální pacienti mají genotyp MM). Nejběžnější alela vedoucí k závažnému nedostatku AAT se nazývá Z (E342K). Bylo hlášeno, že 95% pacientů s těžkou AATD má genotyp ZZ a má pouze 10-20% sérových hladin SerpinA1 . V případě mutace ZZ se protein SerpinA1 nemůže správně složit a nebude vylučován hepatocyty; proto AATD není způsobena neschopností vytvářet protein, ale neschopností vylučovat funkční protein. Akumulace ZZ SerpinA1 v hepatocytech vede k závažnému poškození jater . Homozygotní PIZZ je poměrně častý a vyskytuje se u 1:2500-3000 narozených v Severní Americe a Evropě.

Alpha-1-antitrypsin (AAT), také známý jako SERPINA1 (serinové proteázy, skupina A, člen 1), je vylučovaný protein produkovaný hlavně hepatocyty a v menší míře mononukleární fagocyty, neutrofilů, a dýchacích cest/střevní epitelové buňky . SerpinA1 je cirkulující glykoprotein, který je také rozpustný ve vodě a tkání difúzní . Primární úlohou SerpinA1 je regulace serinové proteázy a hlavní místo tohoto účinku je v plicích. Tam SerpinA1 váže a inaktivuje neutrofilní elastázu, čímž chrání alveolární tkáně před proteolytickou degradací během zánětlivých odpovědí . Serpina1 je nejhojnější cirkulující antiproteáza a normální plazmatické koncentrace SerpinA1 obvykle dosahují 1-2g / l.

AATD je charakterizován polymerace patologickou konformací SerpinA1 proteinů v hrubém endoplazmatickém retikulu hepatocytů, které snižuje koncentraci a aktivitu SerpinA1 v krvi a tkáních . U pacientů se závažným nedostatkem jsou sérové hladiny SerpinA1 nižší než 50 mg / dL, zatímco normální hladiny jsou 200 mg/dl. Při nízkých hladinách cirkulujícího SerpinA1 nejsou plíce chráněny před neutrofilní elastázou, enzymem, který ničí alveoly a způsobuje plicní onemocnění. Proto jsou nejčastějšími klinickými komplikacemi aatd plicní emfyzém a onemocnění jater .

K dnešnímu dni je k léčbě AATD k dispozici pouze augmentační terapie AAT. Augmentační terapie AAT byla vyvinuta v roce 1987 a je v současné době schválena pouze pro komerční použití u vybraných pacientů se závažným plicním emfyzémem souvisejícím s aatd . AAT augmentace pouze pomáhá dodávat SerpinA1 do plic, kde může pomoci zabránit poškození neutrofilní elastázy. Protože nedostatek séra není příčinou poškození jater, neexistuje žádná specifická léčba u pacientů trpících onemocněním jater spojeným s AATD. Jedinou léčbou je podpůrná péče o typické selhání jater a transplantaci jater u pacientů s dekompenzovanou cirhózou .

aatd je monogenní porucha, která z něj činí ideální cíl pro terapii mRNA. mRNA je román modality, které je potenciálně použitelné pro širokou škálu onemocnění, protože jeho obrovskou flexibilitu než tradiční biologické a enzymatickou substituční terapií. mRNA-based therapeutics využít hostitelské buňky je endogenní strojní zařízení pro výrobu a posttranslační modifikace cílových proteinů, což umožňuje, pro rozvoj léčiv pro nemoci dříve dohledat. Provedli jsme studie in vitro a in vivo, abychom zjistili, zda můžeme exogenně kódovat serpina1 a zacílit mRNA / protein na příslušný orgán.

léčba mRNA by mohla potenciálně cílit jak na játra, tak na plíce pacientů s deficitem AAT (až do současných experimentů). Naše data prokázala zvýšený protein SerpinA1 v médiu buněčné kultury léčených fibroblastů pacienta AAT, stejně jako v médiu buněčné kultury primárních hepatocytů odvozených od fibroblastů pacienta AAT. Navíc u zvířat WT dostávajících mRNA SERPINA1 intravenózní injekcí bylo pozorováno, že jak mRNA SERPINA1, tak protein SerpinA1 jsou lokalizovány jak v játrech, tak v plicích. Společně naše data naznačují, že mRNA zprostředkovaná exprese proteinu SerpinA1 v plicích by mohla inhibovat neutrofilní elastázu, zatímco by mohla podporovat expresi MM izoformy v játrech a poskytnout více cest přínosů pro pacienty s AAT.

2. Materiály a metody

2.1. Fibroblasty pacientů s aatd

podmínky buněčné kultury. Následující fibroblasty pacientů byly získány z Coriell Institute for Medical Research, Cell Repository (Camden, NJ) : GM11423 a GM12445 z jater pacienta aatd a GM02522 z kůže pacienta aatd a normální kontrolní fibroblastová linie ND34769 z kůže. Buňky byly pěstovány v Eagle ‚s Minimum Essential Medium with Earle‘ s solí a neesenciálních aminokyselin (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) doplněno 15% fetálním bovinním sérem a inkubováno při 37°C v 5% CO2.

podmínky transfekce. Fibroblasty pacientů byly transfektovány 2.5ug každé mRNA a 4 µl mRNA-V lipidové transfekci činidlem (MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD), ve 3 nezávislých experimentů s 3 biologických replikátů za experiment. Každá mRNA byla zředěna na 2,5 µg v Optimemu (Thermo Fisher Scientific, Inc ., Waltham, MA) a podobně vhodný objem mRNA-In byl zředěn OptiMEM na jamku a protokol byl dodržen podle doporučení výrobce. Zředěná mRNA se smísí se zředěným lipidem a nechá se inkubovat po dobu 15 minut při pokojové teplotě před přidáním do buněk. Po přidání směsi mRNA-lipidů k pacientovým fibroblastům byly buňky vráceny do inkubátoru při 37°C s 5% CO2. Po 24 hodinách byly buňky jemně promyty pomocí PBS dvakrát a lyžují v čerstvé RIPA pufr (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) s 1X inhibitory proteáz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

lýze Buněk a celkové bílkoviny kvantifikace: pacient fibroblastů buněčné lyzáty byly shromážděny v 0,5 mL zkumavky (Eppendorf, Hamburg, Německo) a centrifugována při 18000 × g a při 4°C pro odstranění zbytků buněk. Po centrifugaci byl čirý supernatant opatrně přenesen do samostatné označené zkumavky a umístěn na led. Celková koncentrace proteinu byla stanovena pomocí BCA assay kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) ve dvojím vyhotovení ve formátu 96 jamek podle protokolu výrobce.

Wes automatizovaná kapilární elektroforéza pro expresi SERPINA1. Konečné vzorky po 5 µl v koncentraci 0, 4 mg/mL proteinu byly připraveny podle pokynů výrobce Protein Simple Wes. Lyzáty byly analyzovány pomocí kapilárního elektroforézního systému založeného na velikosti proteinu Simple Wes (ProteinSimple Wes; ProteinSimple, San Jose, CA). Velikost-oddělené proteiny zkoumali protilátky specifické pro SERPINA1 v 1:125 ředění (Novus NBP1-90309, Novus Biologics, Littleton, CO) a hospodyně Thioredoxin na 1:1000 (CST 2429, Buněčné Signalizace Technologies Inc., Danvers, MA), vizualizováno pomocí značených sekundárních protilátek králíků a kvantifikováno pomocí softwaru výrobců. Pro každý pruh byla plocha pod křivkou (AUC) serpina1 normalizována na AUC kontroly Thioredoxinu.

2.2. Hepatocyty s deficitem alfa-1 antitrypsinu

podmínky buněčné kultury. Hepatocyty odvozené od pacienta aatd byly generovány z fibroblastů aatd společností DefiniGen (Cambridge UK) pomocí proprietárního diferenciačního protokolu. Buňky byly pěstovány v DTM media a media DRM (DefiniGen, Cambridge, UK) a pozlacený 500 000 buněk na jamku ve 24-deska. Buňky byly pěstovány v hypoxických podmínkách při 37°C v 5% CO2 a 5% O2 s médii měněn každé dva dny po dobu 10 dnů před transfekce na základě vlastnických výrobce protokol (DefiniGen, Cambridge, UK). Buňky byly pěstovány v hypoxických podmínkách podle pokynů výrobce, což umožnilo růst buněk, zatímco nehypoxické podmínky snížily růst buněk.

podmínky transfekce a exprese proteinu pomocí ELISA. Hepatocyty AATD byly transfektovány 4ul Lipofektaminu® 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc ., Waltham, MA) na 2.5UG mRNA, ve 3 nezávislých experimentech se 3 biologickými replikáty na experiment. Buňky byly poté inkubovány po dobu 24, 48, a 72 hodin před média pro buněčné kultury byly odstraněny a testovány pro SerpinA1 koncentrace proteinu pomocí ELISA z Abcam (Cambridge, MA) a následující výrobce protokol.

2.3. In Vivo Studie,

Všechny experimenty, ustájení zvířat, manipulace a experimentální postupy/protokoly byly schváleny a provedeny v souladu s Alexion Pharmaceuticals Inc. Pokyny a předpisy IACUC. V této studii byl použit c57bl / 6 samců myší (6týdenní). Myši byly drženy v prostředí s řízenou teplotou s cyklem 12-h/12-h světlo-tma, se standardní dietou a vodou ad libitum.

formulace mRNA do lipidových nanočástic a dávkování In vivo. konstrukce mRNA byly formulovány za použití Samosběrné ionizovatelné lipidové nanočástice (LNP) obsahující mRNA SERPINA1. GFP kódující mRNA byla použita jako řízení vozidla nabité mRNA a PBS byla použita jako negativní kontrola v tomto experimentu. LNP byly připraveny rychlým smícháním mRNA v acetátovém pufru při pH 4.0 s lipidovou směsí, Hepato9 mRNA kit (Precision NanoSystems), suspendovaný v ethanolu v poměru lipid k léčivu ~11 (wt/wt). Zvířatům byla podána jednorázová intravenózní dávka 1,5 mg/kg formulované mRNA přes ocasní žílu. Zvířata byla obětována 24 hodin po injekci a tkáně byly fixovány a zpracovány pro in situ hybridizaci (ISH) a imunohistochemii (IHC).

odběr vzorků a příprava vzorku FFPE. Zvířata byla nekropsována a levý boční lalok byl umístěn naplocho do tkáňových kazet (Fisher Scientific). Kazety byly poté umístěny do nádoby naplněné 10% neutrálním Pufrovaným formalinem, fixačním roztokem NBF (Sigma)v poměru minimálně 1: 20 objemu tkáně versus fixační roztok. Vzorky se nechaly fixovat po dobu minimálně 24 hodin, ale ne více než 48 hodin při pokojové teplotě. Po fixaci tkáně byla kazeta umístěna do nádoby naplněné PBS po dobu nejvýše 3 dnů. Po promytí PBS byly jaterní tkáně zpracovány a vloženy do parafinových bloků.

2.4. Imunohistochemie a In Situ Hybridizace Postupy

Imunohistochemie pro SERPINA1 byla provedena na formalin-fixed paraffin-embedded, 5 µm tkáňových řezů pomocí protilátek, aby SERPINA1 (Atlas, HPA001292 na 1:100). Imunostaining byl proveden na platformě Leica BOND RX (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) podle standardních protokolů s příslušnými pozitivními kontrolami. Antigen retrieval, standardně na platformě Leica BOND RX, využil řešení Leica ER1, EDTA-Tris, pH 8.0. Diapozitivy byly dehydratovány ve tříděné ethanolové sérii, vyčištěny v xylenu a namontovány pomocí Cytoseal. Snímky byly zobrazovány pomocí systému VS120 při 40násobném zvětšení (Olympus).

pro vizualizaci mRNA byla provedena In situ hybridizace (ISH). Vlastní RNA in situ hybridizační sonda (Affymetrix, Santa Clara, CA) byla navržena pro detekci mRNA SERPINA1. Automatizovaný test RNA ISH byl proveden pomocí detekční sady ViewRNA eZ-L (Affymetrix, Santa Clara, CA) a platformy Leica BOND RX (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) byl použit. Formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tkání byly připraveny v 5 um tloušťky na skleněné diapozitivy a dát na Leica DLUHOPISŮ RX. Na ViewRNA eZ-L test byl spuštěn podle vyrábí protokolu, ale, stručně, RNA byl odhalen s 10-min inkubace při 95°C v Bond Epitope Retrieval Solution 1 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL), následuje 20-ti minutách inkubace s proteinázu K z vazby Enzymu Předčištění Sada na 1:1000 ředění (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Hybridizace byla provedena s ředěním sondy SERPINA1 1: 40 a následnou detekcí FastRed. K zajištění RNA integrity a postup testu, další části byly také hybridizované se sondou pro peptidyl prolyl izomeráza B (PPIB), endogenní úklid bílkovin použita jako pozitivní kontrola pro ISH. Pro kontrolu nespecifického barvení byla jako negativní kontrola použita kontrolní sonda proti bakteriální proteinové dihydrodipikolinátreduktáze (dapB). Všechny sondy byly na ředění v poměru 1: 40. Sklíčka byla vysušena na vzduchu, vyčištěna v xylenu a namontována pomocí Cytoseal. Snímky byly zobrazovány pomocí systému VS120 při 40násobném zvětšení (Olympus).

3. Výsledky

3.1. mRNA Odvozené Lidské SerpinA1 Výraz v Buněčné Lyzáty a Mobilní Média Pacienta Fibroblastů a Fibroblastů Pacienta Odvozené od Primárních Hepatocytech

Lidské SERPINA1 mRNA z TriLink byl transfektovaly do AATD pacienta fibroblasty, získané z Coriell Ústavu. Významné zvýšení exprese lidského proteinu SerpinA1 bylo pozorováno u buněčných lyzátů(Obrázek 1 (A)) a buněčných kultivačních médií (Obrázek 1(b)) po transfekci divokého typu (WT) nebo SERPINA1 označeného vlajkou (FT).

(a)
(a)
(b)
(b)

(a)
(a)(b)
(b)

Figure 1
In vitro human SerpinA1 expression in cell lysates (a) and cell media (b) from AATD patient fibroblasts and normal skin fibroblasts. Vehicle control is GFP mRNA; WT-SERPINA1 is WT mRNA sequence; FT-SerpinA1 is flag-tagged mRNA sequence.

lidská serpina1 mRNA transfekce byla také provedena u primárních hepatocytů odvozených od fibroblastů pacientů získaných z Definigenu. Sekrece proteinu WT SerpinA1 do kultivačního média byla zvýšena za 24 hodin ve srovnání s kontrolou mRNA GFP pouze vehikulem. Pozorovali jsme konzistentní zvýšení exprese proteinu SerpinA1 v průběhu času, jak je vidět při 48h a 72 h po transfekci (Obrázek 2).

Figure 2
In vitro human SerpinA1 expression in cell culture media obtained from patient fibroblast-derived hepatocytes (DefiniGen, Cambridge UK).

3.2. In Vivo Human SerpinA1 Expression in WT Mice

Human SerpinA1 protein expression was subsequently evaluated in WT C57bl/6 mice. Lidské SERPINA1 mRNA byla pozorována v játrech (Obrázek 3(a)), pokud lze očekávat, že vzhledem k tomu, že mRNA je zapouzdřen v lipidových nanočástic, které obecně přináší velké množství jeho nákladu do jater. Zajímavým zjištěním bylo, že mRNA SERPINA1 byla detekována také v plicích myší (obrázek 3(b)). Exprese proteinu SerpinA1 byla detekována pomocí lidské specifické protilátky SerpinA1. Protein SerpinA1 byl pozorován jak v játrech (obrázek 3(C)), tak v plicích (obrázek 3(d)). Sinusový distribuční vzorec exprese proteinu SerpinA1 v játrech naznačuje, že protein SerpinA1 je pravděpodobně vylučován do krve hepatocyty.

(b)

(c)(string)

div>

(d)(d)

(a)
(a)(b)
(b)(redet)
(d)
(d)
in vivo lidské serpina1 mrna biddistribution v játrech(a) a plic(b) wt mippa 24h poté, co jsem.v. byl detoxedted opak ISH. Červené tečky na obrázku představují mRNA. Protein SerpinA1 byl vizualizován v játrech (c) a plicích (d) pomocí IHC.

4. Diskuse

AATD je devastující onemocnění s potřebou účinné terapie ve prospěch pacientů. Současná augmentační terapie je nedostatečná, aby se zabránilo dlouhodobému poškození jater pacientů s AATD. V současné době mnoho skupin sleduje nové způsoby poskytování tolik potřebných terapií, jako je genová terapie. Například transplantace kmenových buněk odvozených od kostní dřeně byla testována u myší AATD a prokázala určitou záchranu zhoršení hepatocytů . Gen náhradní strategie jsou také testovány na klinice , kde WT SERPINA1 gen je vložen do jater a vyjadřuje příslušnou SerpinA1 bílkovin. Současné metody ještě musí být optimalizované a AAV-zprostředkované genové dodání může způsobit protilátkami zprostředkované snížení proteinu sekrece nebo imunologické reakce na virový kapsidový.

hodnotili Jsme účinek přechodné výraz SERPINA1 mRNA v játrech myší jako mRNA dodání jater je poměrně jednoduché a zavedené přes lipidové nanočástice (LNP), a můžeme podávat LNP-zapouzdřené mRNA bez výrazné imunitní reakce. Zpočátku jsme testovali naši hypotézu u fibroblastů pacientů aatd a primárních hepatocytů odvozených od fibroblastů pacientů. Naše data jasně ukazují, že můžeme kódovat serpina1 s mRNA a následně exprimovat serpina1 protein z obou typů buněk. Také prokazujeme, že z těchto buněk je vylučován protein SerpinA1 a hladiny bílkovin lze měřit v supernatantovém / buněčném kultivačním médiu. To znamená, že protein serpina1 kódovaný mRNA je složen a vhodně modifikován v buňce, aby umožnil sekreci z ER a do média buněčné kultury, což je klíčovým rysem této terapie mRNA. S využitím terapie mRNA můžeme využít vlastní buňky těla jako továrnu na syntézu bílkovin, posttranslační modifikaci a nakonec je vylučovat do krevního oběhu. Předběžná analýza média buněčné kultury ukazuje, že vylučovaný SerpinA1 je enzymaticky aktivní v testu inhibice neutrofilní elastázy (údaje nejsou uvedeny). Naše údaje na obrázcích 1, 2 a 3 naznačují, že hladiny proteinu SerpinA1 jsou významně vyšší než výchozí nebo negativní kontrolní hladiny. Tyto hladiny by měly být dostatečné ke snížení aktivity neutrofilní elastázy v plazmě a plicích, a tím zabránit alveolární degradaci a emfyzému, které jsou charakteristické pro AATD.

rozšířili jsme naše studie, abychom zjistili, zda lze serpina1 kódovaný mRNA exprimovat in vivo. Naše studie ukazují, že intravenózně podaná lidská mRNA SERPINA1 dosáhla jater i plic u myší WT (obrázky 3(A) a 3 (b)). Terapie mRNA zapouzdřená lipidy by tedy mohla potenciálně cílit na obě místa AATD (játra a plíce). Ještě důležitější je, že lidský protein SerpinA1 byl produkován jak v játrech, tak v plicích myší WT (obrázky 3(c) a 3 (d)). V SerpinA1 exprese proteinů vzor v jaterní sinusoidy ukazuje, že proteiny jsou secernován hepatocyty nebo jiné jaterní buňky typu, jako hvězdicovité buňky, které se normálně vyjádřit SERPINA1. Naše data nemohou vyloučit možnost, že mRNA vstupuje nebo je vyjádřen jiné jaterní buňky kromě hepatocytů, a to bude vyžadovat další práci. Je možné, že lidské SerpinA1 bílkovin v plicích může přijít ze dvou zdrojů: SERPINA1 mRNA, která dosáhla plic prostřednictvím jsem.v. injekce, stejně jako vylučuje lidské SerpinA1 produkován lidské SERPINA1 mRNA v játrech. V každém případě, potenciál pro SerpinA1 proteinové exprese a lokalizace v plicích a játrech je slibné, jak by to mohlo blokovat neutrofilní elastáza-zprostředkované poškození v plicích, zatímco možná klesající PIZZ tvoří v játrech. Druhá hypotéza je založena na studiích Karadagi et al. přičemž zvýšení proteinu SerpinA1 augmentační terapií prokázalo snížení formy PIZZ u PBMC pacienta s AATD. To zvyšuje možnost, že protein serpina1 kódovaný mRNA, pokud je exprimován v játrech, by mohl snížit produkci jaterní formy PIZZ a následně inhibovat jaterní fibrózu. Inhibice jaterní fibrózy a ER stresu by nakonec mohla snížit / eliminovat potřebu aatd pacienta pro transplantaci jater. Naše hypotéza musí být testována in vivo v modelu aatd, který demonstruje fibrózu jater a progresi k hepatocelulárnímu karcinomu.

Zatímco tyto jsou zajímavé údaje, rádi bychom poukázat na to, že mRNA terapie je třeba zlepšit, aby potenciálně poskytnout chronické přínos pro AATD pacientů. Současné poločasy exogenně dodávané mRNA jsou obvykle 24-48h v tkáni, zatímco proteinové poločasy se liší v závislosti na proteinu a jeho degradačních mechanismech. Strategie pro zvýšení poločas mRNAs jsou v současné době předmětem vyšetřování a včasné údaje naznačují, že můžeme zvýšit dobu trvání mRNA stability modulací UTRs lemující kodon-optimalizované mRNA . Strategie racionálního proteinového inženýrství jsou také zaměřeny na usnadnění zvýšeného poločasu proteinu, což má za následek zvýšenou enzymatickou aktivitu a nakonec sníženou potřebu dávkování terapie mRNA . Tato nová zlepšení by mohla vést k léčbě mRNA, která je dávkována zřídka a udržuje dostatečnou enzymatickou aktivitu, např. Dalším aspektem, který by zlepšil terapie mRNA, je bezpečnost dodávky LNP, kdy můžeme dávkovat LNP každých několik týdnů. Současná technologie LNP usnadňuje dávkovací režim jednou za měsíc, ale nepodporuje častější dávkování, pokud spárujeme dávkování s účinností. Jak již bylo zmíněno dříve, LNP-zapouzdřené mRNA terapie může být redosed, na rozdíl od některých AAV-genová terapie, a dávka může být titrována tak, aby poskytovaly maximální přínos pro pacienta.

5. Závěr

Naše studie představují potenciální nové terapeutické modality, mRNA terapie, přičemž chybějící nebo nefunkční protein může být nahrazen vykonávat normální funkce. Naše zjištění ukazují, že mRNA zapouzdřená lipidy může být zaměřena na plíce a játra, které jsou dvěma primárními místy onemocnění v AATD. Zatímco předchozí studie zkoumající mRNA terapie pro AATD ukázaly, exprese proteinů na 24h v A549 a HEK293 buněk , naše studie ukazují, SerpinA1 exprese proteinů v AATD fibroblastů pacienta a pacient-odvozené hepatocytů, které jsou příslušné buněčné linie pro nemoc. Kromě toho jsme rozšířit předchozí studie v této oblasti tím, že prokáže, že lipid-zapouzdřené mRNA lze dodat na myších jater a plic a vyrábět SerpinA1 bílkoviny, které mají být funkčně důležité pro pacienty. Je třeba provést další výzkum v modelu onemocnění AATD a zajistit bezpečnost opakovaného dávkování mRNA u hlodavců a vyšších zvířat před zvážením této modality pro lidské použití. Společně naše studie zvyšují zajímavou možnost, že terapie mRNA využívající mRNA SERPINA1 by mohla být prospěšná pro pacienty s AATD.

dostupnost dat

všechny údaje podporující výsledky publikované v tomto článku jsou uvedeny v článku. Nejsou k dispozici žádné další údaje.

střety zájmů

všichni autoři jsou zaměstnanci a akcionáři společnosti Alexion Pharmaceuticals, Inc., společnost, která vyvíjí terapie pro vzácná a ultrarare onemocnění.

příspěvky autorů

Brendan Connolly navrhl a provedl buněčnou kulturu, transfekce a zpracování vzorků in vivo. Cleo Isaacs navrhl a provedl IHC. Lei Cheng navrhl a provedl experimenty ISH, psaní rukopisů a studie in vivo. Kirtika h. Asrani provedl západní bloty, imunoanalýzy, a zpracování vzorků in vivo. Romesh R. Subramanian navrženy experimenty, přezkoumal údaje, a je autorem rukopisu

Poděkování

Alexion Pharmaceuticals, Inc., je uznán za financování.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.