Articles

ressourcer

introduktion

Immunoassay er en biokemisk metode, der identificerer og kvantificerer ukendte analytter (protein, lipid, nukleinsyre osv.) i opløsning (serum, urin osv.) anvendelse af antistof-antigenreaktioner. Der er mange forskellige formater og variationer af et immunoassay, men nøglepunktet er stadig specifik antistof-antigengenkendelse. Hvad er et antigen og et antistof? Hvorfor kan et antistof binde til et antigen?

et antigen er et molekyle, der genkendes af immunsystemet, især af antistoffer. Proteiner, polysaccharider, pesticider, antibiotika, toksiner og hormoner kan alle være antigener. Men ikke alle antigener kan stimulere immunsystemet til at generere antistoffer. Et antigen, der kan fremkalde et immunrespons, og især antistofsyntese kaldes et immunogen. Proteiner med molekylvægte højere end 5-10 kDa er immunogener, mens små peptider, pesticider, antibiotika eller hormoner ikke er. Disse stoffer med lav molekylvægt kaldes haptener og skal kemisk kobles til større bærermolekyler, såsom bovint serumalbumin eller nøglehul limpet hæmocyanin, for at fremkalde specifik antistofdannelse.

et antistof er et Y-formet stort protein (160 kDa), der bærer to kombinationssteder (paratoper), der binder til en begrænset overflade (epitop) af antigenet specifikt. Epitoper er for det meste placeret på den hydrofile del af antigenet, og deres størrelse er 10-15 aminosyrerester, der kan være sammenhængende på proteinkæden (lineær epitop) eller diskontinuerlig, men alligevel rumligt tæt på proteinkæden.

antistof-antigenreaktionen er en typisk reversibel bimolekylær reaktion med hastighedskonstanter for de fremadrettede og bagudrettede reaktioner, der er afhængige af koncentrationen af antigenet (Ag) og antistoffet (Ab), affinitet for antigenet som defineret af antistoffets associeringskonstant for dets antigen, temperatur, pH og andre miljøforhold. Immunoassays er baseret på binding og kompleks af et antigen til et antistof, og folk bruger nogle fysiske eller kemiske midler til at måle og kvantificere antigen-antistofkomplekset.

Antigen og antistof

Figur 1. Antigen og antistof. (a) små molekyler kan genkendes af antistof, men kan ikke stimulere immunsystemet til at producere antistof. De skal kombineres med adjuvanser (normalt proteiner) for at danne et immunogen. Proteiner kan altid være et immunogen. (B) antistof kan genkende strukturelle specifikke områder på antigen, som kaldes epitop. Genkendelsesområderne på antistoffet kaldes paratoper. (c) et antistof er en Y-formet molekylær. (d) et antistof består af to tunge og to lette kæder forbundet med disulfidbindinger. Fab-fragmenterne af H-og L-kæder er meget variable, og Fc-fragmenterne er konservative.

Immunudfældning

Der er udviklet en række metoder til visualisering af den primære Ag-Ab-reaktion. Udfældning af store tværbundne Ag-Ab-komplekser kan være synlige for de blotte øjne uden brug af mærkede reagenser til amplifikation.

udfældningsreaktionen er en meget specifik serologisk reaktion, der involverer binding af antigen med antistof. Hvert antistof har to antigenbindingssteder, og hvert antigen har flere antigene epitoper. Når opløselige antigener er bundet af antistof til dannelse af en tværbundet “gitter”-struktur, kaldes reaktionen udfældning. Udfældningsreaktionen hæmmes, når enten antigen eller antistof er til stede i stort overskud. Området for optimale koncentrationer, hvor den største mængde nedbør genereres, kaldes det tilsvarende område. Baseret på dette princip kan tilstedeværelsen af specifikke antigener i en blanding og den relative koncentration af antigener detekteres ved anvendelse af antistoffer.

Immunodiffusionsmekanisme

figur 2. Immunodiffusionsmekanisme. (a) mængden af udfældning påvirkes af koncentrationen af antistof og antigen. (B) skematisk af radial immunodiffusion. (C) skematisk af dobbelt immunodiffusion.

to typer udfældningsreaktioner kan anvendes til at bestemme relative koncentrationer af antistoffer eller antigener. De er radial immunodiffusion (Mancini-metoden) og dobbelt immunodiffusion (ouchterlony-metoden). Begge udføres i et halvfast medium, såsom agar. Ved radial immunodiffusion anbringes en antigenprøve i en brønd og får lov til at diffundere i agar indeholdende en passende fortynding af et antiserum. Når antigenet diffunderer ind i agaren, etableres ækvivalensområdet, og der dannes en udfældningsring såvel som en udfældningsring omkring brønden (figur 2b). Området af præcipitinringen er proportional med koncentrationen af antigen. Ved at sammenligne arealet af præcipitinringen med en standardkurve (opnået ved måling af udfældningsområderne med kendte koncentrationer af antigenet) kan koncentrationen af antigenprøven bestemmes. I ouchterlony-metoden diffunderer både antigen og antistof radialt fra brønde mod hinanden og derved etablerer en koncentrationsgradient. Når ækvivalensen nås, dannes en synlig udfældningslinje (figur 2C).

selvom det er nyttigt, er immunodiffusion og immunoelektroforese kedelig og tidskrævende, vanskelig at automatisere og ikke let anvendt til masseprøveanalyse.

mærket Immunoassay

Immunoassays anvender en række forskellige mærker for at muliggøre påvisning af antistoffer og antigener. Etiketter er typisk kemisk bundet eller konjugeret til det ønskede antistof eller antigen.

i henhold til forskellen mellem etiket og signaldetekteringsstrategi kan immunoassay klassificeres som følgende typer:

1. Radioimmunoassay (RIA)

RIA er et immunoassay, der bruger radioaktive isotoper (f.eks. Det detekterer radioaktiviteten for at måle antistof-antigenforbindelsen med meget høj følsomhed. RIA var nogle af de tidligste udviklede immunoassays og faldt ud af favør hovedsageligt på grund af vanskelighederne og potentielle farer ved at arbejde med radioaktivitet.

2. EIA er muligvis en af de mest populære anvendte immunoassays. I stedet for radioaktive isotoper bruger VVM (f.eks. Detektion ofte fordi de producerer en observerbar farveændring i nærvær af visse reagenser af substrat og kromogen (f.eks.

Lær mere om ELISA Kit udvikling

3. Fluoroimmunoassay (FIA)

FIA er analog med RIA bortset fra at etiketten er en fluorophore (f.eks. FITC, phycoerythrin) snarere end en radioisotop. Fluorescens signal kan måles direkte ved at detektere instrument.

4. Chemiluminescence Immunoassay (CLIA)

CLIA er en metode til at bestemme koncentrationen af prøver i henhold til intensiteten af luminescensen, som den kemiske reaktion udsender. CLIA kombinerer CL-systemerne og immunreaktionerne. Nogle reagenser er blevet brugt som Cl-etiketter. Efter indførelsen af CL-substraterne producerer systemet kemiluminescens. Så prøverne kan detekteres kvantitativt. De mest populære Cl-substrater er luminol, isoluminol og deres derivater, acridiniumesterderivat, peroksidase og alkalisk phosphatase (Alp).

5. Immunochromatograohic Assay (ICA)

ICA også kendt som lateral strømningsimmunoassay er en hurtig testimmunoassay for at detektere tilstedeværelsen (eller fraværet) af en målanalyt i prøve (matrice) uden behov for specialiseret og dyrt udstyr. I denne form for analyse immobiliseres fangstantistoffer som en tværlinie på et porøst hydrofilt materiale. Analytter i buffer tilsættes derefter på den ene side af teststrimlen, drevet af den laterale kapillærkraft. Analytterne strømmer igennem over fangstantistoflinjen og fanges af antistof. Da de fangede analytter akkumulerede, kunne komplekset afsløres af nanopartikelmærkerne (normalt kolloidt guld) og ses direkte med blotte øjne.

sammenligning af de fem forskellige mærkede immunoassays ovenfor er angivet i nedenstående tabel. Hver metode har sine egne fordele og ulemper, så vi kunne vælge det mest passende middel fleksibelt til at optimere vores test.

Illustration Label Substrates Signal Sensitivity Advantages Drawbacks
Radioimmunoassay
(RIA)
Radioimmunoassay Radioactive
Isotopes
(I-125)
None Radiation Ultrahigh 1. Sensitive and precise
2. Radio-label conjugation easy to prepare
1. Radioisotoper skal anvendes inden for få uger
2. Risiko for strålingseksponering

(VVM)
Immunoassay
(HRP,AP)
Chromogen/ substrat farveændring høj 1. Følsom og sikker
2. Hurtig og bekvem, nem at automatisere
3. Udbredt i forskellige test
1. Har brug for monoklonalt antistof
2. Ikke-specifik absorption
3. Reaktionen er kortvarig og skal læses snarest.
Fluoroimmunoassay
(FIA)
Fluorenscence Immunoassay Fluorogenic
Reporters
(Rhodamine)
None Fluorescence High 1. Sensitive, specific and save
2. Limited background fluorescence
3. Easy to automation
4. multiple label can be used
1. Rely on fluorescence detecting instrument
2. Photo bleaching
Chemiluminescence
Immunoassay
(CLIA)
Chemiluminescence Immunoassay Chemical
probes
(Acridinium Ester, luminol)
luminescence substrate Visible light Ultrahigh 1. Excellent sensitivity and safe
2. Stable of reagent
3. Let at automatisere, kan bruges i høj gennemløbssystem
har brug for CCD-udstyr til at fange lyssignalet
kolloidalt guld
immunokromatografisk
Assay
(ICA)
kolloidalt guld Immunokromatorgrafisk Assay kolloidalt guld
nanopartikel
ingen synlig farve lav 1. Hurtig, nem at bruge
2. Billig og sikker
3. Synlig, uden udstyrsfaciliteter
lav følsomhed og specificitet

6. Immunhistokemi (IHC)

IHC kombinerer histologiske, immunologiske og biokemiske teknikker til identifikation af specifikke vævskomponenter ved hjælp af en specifik antigen/antistofreaktion mærket med en synlig etiket. IHC gør det muligt at visualisere fordelingen og lokaliseringen af specifikke cellulære komponenter i en celle eller væv. Den mest populære type IHC er kromogen og fluorescensdetektion medieret af henholdsvis et fluorofor, hvilket grundlæggende princip er lig med EIA og FIA.

Label Free Immunoassay

mens en slags etiket generelt anvendes i immunoassays, er der visse former for assays, som ikke er afhængige af etiketter. I stedet skal du anvende detektionsmetoder, der ikke kræver ændring eller mærkning af komponenterne i analysen. Overfladeplasmaresonans (SPR) og kvartskrystallmikrobalance er to typiske etiketfrie metoder.Overfladeplasmaresonans er resonansoscillationen af ledningselektroner ved grænsefladen mellem et negativt og positivt permittivitetsmateriale stimuleret af indfaldende lys. Det er i det væsentlige massen af analyt bundet til sensorchipens substratfilm, der ændrer brydningsindekset, der kan måles på forskellige måder. Intet mærket reportermolekyle er nødvendigt. Da ændringerne i SPR forekommer hurtigt og kan overvåges i realtid, kan bindingsreaktionskinetik undersøges.

kvarts krystal mikrobalance baseret på den omvendte piesoelektriske effekt. Masseaflejringen på elektrodeoverfladen er proportional med substratkrystallens resonansfrekvens. Hvis vi immobiliserer indfangningsantistof på elektrodeoverfladen af chippen og strømmer analytten, kunne bindingsprocessen for antistof og analyt måles ved påvisning af frekvensændring uden nogen etiket af antistof eller antigen.

Darvish i A. Immunoassay metoder og deres anvendelser i farmaceutisk analyse: grundlæggende metode og nylige fremskridt. Int J Biomed Sci, 2006, 2: 217-235.
Immunodiagnostisk teknologi og dens anvendelser. Fremskridt inden for Fødevarediagnostik, 2008: 211.
Brandon D L, Carter J M. Immunoassay. Håndbog for Fødevaresikkerhedsteknik, 2012: 279-312.
Ricchiuti V. IMMUNOASSAY-baserede teknologier F eller måling af biologiske materialer, der anvendes til opdagelse af biomarkører og translationel forskning. Biomarkører: inden for medicin, Lægemiddelopdagelse og Miljøsundhed, 2010: 425.
Proll G, Ehni M. Immunoassays. Håndbog for Spektroskopi: anden, forstørret udgave, 2014: 1313-1334.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.