Articles

SERPINA1 mRNA som behandling For Alfa-1 antitrypsinmangel

abstrakt

alfa-1-antitrypsin (AAT) mangel er en genetisk lidelse, der producerer inaktiv/defekt AAT på grund af mutationer i SERPINA1-genet, der koder for AAT. Denne sygdom er forbundet med nedsat aktivitet af AAT i lungerne og aflejring af overdreven defekt AAT-protein i leveren. I øjeblikket er der ingen specifik behandling for leversygdom forbundet med AAT-mangel. AAT lungesygdom behandles ofte med et af flere serumproteinudskiftningsprodukter; imidlertid er langsigtede undersøgelser af effektiviteten af SerpinA1-erstatningsterapi ikke tilgængelige, og det reducerer ikke leverskader i AAT-mangel. mRNA-behandling kan potentielt målrette både leveren og lungerne hos patienter med AAT-mangel. AAT-patientfibroblaster og AAT-patientfibroblastafledte hepatocytter blev transficeret med SERPINA1-kodende mRNA, og cellekulturmedier blev testet for SerpinA1-ekspression. Vores data viser øget SerpinA1-protein i kulturmedier fra behandlede AAT-patientfibroblaster og AAT-patientfibroblastafledte hepatocytter. In vivo undersøgelser i vildtype mus viser SERPINA1 mRNA biodistribution i lever og lunger samt SerpinA1 proteinekspression i disse to målorganer, som er kritisk påvirket af AAT-mangel. Samlet set antyder vores data, at SerpinA1 mRNA-terapi har potentialet til at gavne patienter, der lider af AAT-mangel.

1. Introduktion

Alpha-1-antitrypsinmangel (aatd) er en ødelæggende sygdom med mangel på passende terapier. Nuværende terapier beskytter kun lungerne og kræver i avancerede tilfælde hyppige intravenøse injektioner af plasma-afledt aat-protein. Patienter med AATD er disponeret for obstruktiv lungesygdom og leversygdom (f .eks. cirrose og hepatocellulært carcinom hos børn og voksne). 1-5% af patienterne med diagnosticeret kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD) anslås at have alfa-1-antitrypsinmangel . Selvom det er ekstremt sjældent, er emfysem hos børn med AATD rapporteret, og forekomsten af leversygdom stiger med alderen . Alvorlige symptomer opstår senere i livet, især hos rygere. Hepatiske symptomer på AATD ses sent i livet og kræver ofte levertransplantation. AATD er en arvelig sygdom forårsaget af mutationer i SERPINA1-genet . SERPINA1-genet har to alleler betegnet som M-alleler (normale patienter har en MM-genotype). Den mest almindelige allel, der resulterer i alvorlig AAT-mangel, kaldes å (E342K) . Det er rapporteret, at 95% af de svære aatd-patienter har en genotype af HS og kun har 10-20% af SerpinA1-serumniveauerne . SerpinA1-proteinet kan ikke foldes ordentligt og udskilles ikke af hepatocytter; derfor er AATD ikke forårsaget af manglende evne til at fremstille protein, men en manglende evne til at udskille funktionelt protein. Akkumuleringen af SerpinA1 i hepatocytter resulterer i alvorlig leverskade . Det er ret almindeligt og forekommer hos 1: 2500-3000 fødsler i Nordamerika og Europa.

Alpha-1-antitrypsin (AAT), også kendt som SERPINA1 (serinproteasehæmmer, gruppe A, medlem 1), er et udskilt protein, der hovedsageligt produceres af hepatocytter og i mindre grad af mononukleære fagocytter, neutrofiler og luftvejs / tarmepitelceller . SerpinA1 er et cirkulerende glycoprotein, som også er vandopløseligt og væv diffusibelt . SerpinA1 ‘ s primære rolle er serinproteaseregulering, og hovedstedet for denne handling er i lungerne. Der binder SerpinA1 og inaktiverer neutrofil elastase, hvorved alveolære væv beskyttes mod proteolytisk nedbrydning under inflammatoriske reaktioner . SerpinA1 er den mest udbredte cirkulerende anti-protease, og normale plasmakoncentrationer af SerpinA1 når normalt 1-2 g/l .

AATD er karakteriseret ved polymerisering af misfoldede SerpinA1-proteiner i det grove endoplasmatiske retikulum af hepatocytter, som nedsætter koncentrationen og aktiviteten af SerpinA1 i blod og væv . For patienter med svær mangel er SerpinA1 serumniveauer Under 50 mg/dL, mens normale niveauer er ved 200 mg/dL. Med lave niveauer af cirkulerende SerpinA1 er lungerne ikke beskyttet mod neutrofil elastase, et ferment, der ødelægger alveoler og forårsager lungesygdom. Derfor er de hyppigste kliniske komplikationer af aatd lungeemfysem og leversygdom .

til dato er kun AAT-augmentationsterapi tilgængelig til behandling af aatd. AAT augmentation therapy blev udviklet i 1987 og er kun i øjeblikket godkendt til kommerciel brug hos udvalgte patienter med svær aatd-relateret lungeemfysem . AAT augmentation hjælper kun med at levere SerpinA1 til lungerne, hvor det kan hjælpe med at forhindre neutrofile elastaseskader. Da serummangel ikke er årsagen til leverskade, er der ingen specifik behandling for patienter, der lider af leversygdom forbundet med aatd. Den eneste behandling er understøttende pleje af typisk leversvigt og levertransplantation for patienter med dekompenseret cirrose .

AATD er en monogen lidelse, der gør det til et ideelt mål for mRNA-terapi. mRNA er en ny modalitet, der potentielt kan anvendes til en lang række sygdomme på grund af dens enorme fleksibilitet i forhold til traditionelle biologiske og biologiske erstatningsterapeutika. mRNA-baserede terapier anvender værtscellens endogene maskiner til produktion og posttranslationel modifikation af målproteiner, hvilket muliggør udvikling af terapeutiske midler til sygdomme, der ikke tidligere er målbare. Vi gennemførte in vitro og in vivo undersøgelser for at afgøre, om vi kunne udtrykke eksogent kodet SerpinA1 og målrette mRNA/protein til det relevante organ.

mRNA-behandling kan potentielt målrette mod både leveren og lungerne hos patienter med AAT-mangel (i afventning af aktuelle eksperimenter). Vores data viste øget SerpinA1-protein i cellekulturmedier af behandlede AAT-patientfibroblaster såvel som i cellekulturmedierne fra AAT-patientfibroblastafledte primære hepatocytter. Desuden blev både SERPINA1 mRNA og SerpinA1 protein observeret at være lokaliseret i både lever og lunger hos dyr, der fik SERPINA1 mRNA via intravenøs injektion. Samlet set antyder vores data, at mRNA-medieret ekspression af SerpinA1-protein i lungerne kunne hæmme neutrofil elastase, mens det kunne fremme MM-isoformekspression i leveren og give flere fordele for AAT-patienter.

2. Materialer og metoder

2.1. Aatd-Patientfibroblaster

Cellekulturbetingelser. Følgende patientfibroblaster blev opnået fra Coriell Institute for Medical Research, Cell Repository (Camden, NJ): GM11423 og GM12445 fra aatd patient lever og GM02522 fra aatd patient hud og den normale kontrol fibroblast linje ND34769 fra huden. Celler blev dyrket i Eagle ‘ s minimum Essential Medium med Earles salte og ikke-essentielle aminosyrer (Thermo Fisher Scientific, Inc. 15% føtalt bovint serum og inkuberet ved 37 kg C i 5% CO2.

Transfektionsbetingelser. Patientfibroblaster blev transficeret med 2.5ug af hvert mRNA og 4 liter mRNA-in lipidtransfektionsreagens (MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD) i 3 uafhængige eksperimenter med 3 biologiske replikater pr. Hvert mRNA blev fortyndet til 2,5 liter i OptiMEM (Thermo Fisher Scientific, Inc. Tilsvarende passende mængde mRNA-In blev fortyndet i OptiMEM pr. brønd, og protokollen blev fulgt i henhold til producentens anbefaling. Fortyndet mRNA blev blandet med fortyndet lipid og fik lov til at inkubere i 15 minutter ved stuetemperatur, før de blev tilsat til celler. Efter tilsætning af mRNA-lipidblanding til patientfibroblaster blev celler returneret til inkubator ved 37 liter C med 5% CO2. Efter 24 timer blev cellerne forsigtigt vasket med PBS to gange og lyseret i frisk RIPA-buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) med 1 gange proteasehæmmere (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

cellelyse og total proteinkvantificering: patientfibroblastcellelysaterne blev opsamlet i 0,5 mL rør (Eppendorf, Hamborg, Tyskland) og centrifugeret ved 18000 g ved 4 liter C for at fjerne celleaffald. Efter centrifugering blev klar supernatant omhyggeligt overført til et separat mærket rør og anbragt på is. Total proteinkoncentration blev bestemt med BCA assay kit (Thermo Fisher Scientific, Inc. I duplikat i 96-brøndformat i henhold til producentens protokol.

Vi er automatiseret Kapillærelektroforese til SERPINA1-ekspression. De endelige prøver på 5 liter hver ved 0,4 mg/mL proteinkoncentration blev fremstillet efter producentens anvisninger. Lysater blev analyseret under anvendelse af det protein Simple ves-størrelse-baserede kapillærelektroforesesystem (ProteinSimple Ves; ProteinSimple, San Jose, CA). De størrelsesseparerede proteiner blev undersøgt med antistoffer, der var specifikke for serpina1 ved 1:125 fortynding (Novus NBP1-90309, Novus Biologics, Littleton, CO) og husholdersken Thioredoksin ved 1: 1000 (CST 2429, Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), visualiseret ved hjælp af mærkede sekundære antistoffer fra kaniner og kvantificeret ved hjælp af producentens program. For hver bane blev området under kurven (AUC) for SERPINA1 normaliseret til AUC for Thioredoksinkontrollen.

2, 2. Alfa-1 Antitrypsin mangelfulde hepatocytter

Cellekulturbetingelser. Aatd patientafledte hepatocytter blev genereret fra aatd fibroblaster af DefiniGen (Cambridge UK) ved hjælp af en proprietær differentieringsprotokol. Celler blev dyrket i DTM-medier og DRM-medier (DefiniGen, Cambridge UK) og belagt med 500.000 celler pr. Celler blev dyrket i under hypoksiske forhold ved 37 liter C i 5% CO2 og 5% O2, hvor medierne blev ændret hver anden dag i 10 dage før transfektion baseret på proprietær producentens protokol (DefiniGen, Cambridge UK). Celler blev dyrket under hypoksiske forhold i henhold til producentens anvisninger, hvilket muliggjorde cellevækst, mens ikke-hypoksiske forhold reducerede cellevækst.

Transfektionsbetingelser og proteinekspression af ELISA. Aatd-hepatocytter blev transficeret med 4UL Lipofectamine kar 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Valdemar, MA) pr. 2.5UG mRNA, i 3 uafhængige eksperimenter med 3 biologiske replikater pr. Celler blev derefter inkuberet i 24, 48 og 72 timer, før cellekulturmediet blev fjernet og analyseret for SerpinA1-proteinkoncentration ved hjælp af en ELISA fra Abcam (Cambridge, MA) og efter producentens protokol.

2, 3. In vivo-studier

alle forsøg, Husning af dyr, håndtering og eksperimentelle procedurer/protokoller blev godkendt og udført i overensstemmelse med . Iacuc retningslinjer og regler. C57BL / 6 hanmus (6 uger gamle) blev anvendt i denne undersøgelse. Mus blev holdt i et temperaturstyret miljø med en 12-h/12-h lys-mørk cyklus med en standard diæt og vand ad libitum.

formulering af mRNA i Lipid nanopartikler og In Vivo dosering. mRNA-konstruktioner blev formuleret under anvendelse af en selvsamlende ioniserbar lipid nanopartikel (LNP) indeholdende SERPINA1 mRNA. En GFP-kodning mRNA blev brugt som en mRNA-belastet køretøjskontrol, og PBS blev brugt som en negativ kontrol i dette eksperiment. LNP ‘ er blev fremstillet ved hurtig blanding af mRNA i acetatbuffer ved pH 4.0 med en lipidblanding, Hepato9 mRNA kit (Precision NanoSystems), suspenderet i ethanol i et lipid-til-lægemiddel-forhold på ~11 (Vægt/Vægt). Dyr blev injiceret med en enkelt intravenøs dosis på 1, 5 mg/kg formuleret mRNA gennem halevenen. Dyr blev ofret 24 timer efter injektion, og væv blev fikseret og behandlet til in situ hybridisering (ISH) og immunhistokemi (IHC).

prøveindsamling og FFPE-prøveforberedelse. Dyr blev nekropsieret, og den venstre laterale lob blev anbragt fladt i vævskassetter (Fisher Scientific). Kassetter blev derefter anbragt i en beholder fyldt med 10% Neutral bufret Formalin, NBF (Sigma) fikseringsmiddel opløsning ved minimum 1:20 forhold mellem vævsvolumen versus fikseringsmiddel opløsning. Prøver fik lov til at fikse i mindst 24 timer, men ikke mere end 48 timer ved stuetemperatur. Efter vævsfastgørelse blev kassetten anbragt i en beholder fyldt med PBS i højst 3 dage. Efter PBS-vask blev levervæv behandlet og indlejret i paraffinblokke.

2, 4. Immunohistokemi og In Situ Hybridiseringsprocedurer

Immunohistokemi for SERPINA1 blev udført på formalinfast paraffinindlejrede, 5 liter-vævssektioner under anvendelse af et antistof mod SERPINA1 (Atlas, HPA001292 kl 1:100). Immunfarvning blev udført på Leica BOND-platformen (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) i henhold til standardprotokoller med passende positive kontroller. Antigenudtagning, standard på Leica BOND-platformen, anvendte Leica ER1, EDTA-Tris, pH 8.0-opløsningen. Slides blev dehydreret i en graderet ethanolserie, ryddet i ksilenog monteret ved hjælp af Cytoseal. Slides blev afbildet ved hjælp af VS120-systemet ved 40 gange forstørrelse (Olympus).

til mRNA-visualisering blev in situ hybridisering (ISH) udført. Det er en af de mest populære typer af RNA in situ hybridiseringssonde, der er designet til at detektere SERPINA1 mRNA. Der blev udført et automatiseret RNA-ISH-assay ved hjælp af detektion Kit (Affymetrics, Santa Clara, CA) og Leica BOND-platformen (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) blev brugt. Formalinfast, paraffinindlejret (FFPE) væv blev fremstillet ved 5 um tykkelse på glasrutschebaner og sat på Leica-bindingen. Analysen blev kørt i henhold til fremstillingsprotokollen, men kort sagt blev RNA afmasket med en 10-min inkubation ved 95 liter C i Bindingsepitopudtagningsopløsning 1 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) efterfulgt af 20-min inkubation med Proteinase K fra Bond-Forbehandlingssættet ved 1:1000 fortynding (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Hybridisering blev udført med SERPINA1 1:40 sondefortynding efterfulgt af FastRed-detektion. For at sikre RNA-integritet og analyseprocedure blev yderligere sektioner også hybridiseret med en sonde til peptidylprolylisomerase B (PPIB), et endogent husholdningsprotein anvendt som en positiv kontrol for ISH. For at kontrollere for uspecifik farvning blev kontrolprobe mod bakterieproteindihydrodipicolinatreduktase (dapB) anvendt som en negativ kontrol. Alle prober var ved en 1: 40 fortynding. Slides blev lufttørret, ryddet i ksilen og monteret ved hjælp af Cytoseal. Slides blev afbildet ved hjælp af VS120-systemet ved 40 gange forstørrelse (Olympus).

3. Resultater

3.1. mRNA-afledt Human SerpinA1-ekspression i cellelysater og Cellemedier af Patientfibroblaster og Patientfibroblastafledte primære hepatocytter

Human SERPINA1 mRNA fra TriLink blev transficeret til aatd-patientfibroblaster, opnået fra coriell Institute. Signifikant stigning i humant SerpinA1-proteinekspression blev observeret i cellelysater (Figur 1(a)) og cellekulturmedier (Figur 1(b)) ved transfektion af enten vildtype (vægt) eller FLAGMÆRKET (FT) SerpinA1.

(a)
(a)
(b)
(b)

(a)
(a)(b)
(b)

Figure 1
In vitro human SerpinA1 expression in cell lysates (a) and cell media (b) from AATD patient fibroblasts and normal skin fibroblasts. Vehicle control is GFP mRNA; WT-SERPINA1 is WT mRNA sequence; FT-SerpinA1 is flag-tagged mRNA sequence.

Human SERPINA1 mRNA-transfektion blev også udført i patientfibroblastafledte primære hepatocytter opnået fra DefiniGen. Sekretion af vægt SerpinA1-protein i dyrkningsmediet blev øget ved 24 timer sammenlignet med vehicle only GFP mRNA control. Vi observerede en konsekvent stigning i SerpinA1-proteinekspression over tid set ved 48 timer og 72 timer efter transfektion (figur 2).

Figure 2
In vitro human SerpinA1 expression in cell culture media obtained from patient fibroblast-derived hepatocytes (DefiniGen, Cambridge UK).

3.2. In Vivo Human SerpinA1 Expression in WT Mice

Human SerpinA1 protein expression was subsequently evaluated in WT C57bl/6 mice. Human SERPINA1 mRNA blev observeret i leveren (figur 3(A)) som forventet, da mRNA ‘ et er indkapslet i en lipid nanopartikel, som generelt leverer en stor mængde af sin last til leveren. Et spændende fund var, at SERPINA1 mRNA også blev påvist i lungerne hos mus (figur 3(b)). SerpinA1-proteinekspression blev påvist ved anvendelse af et humant specifikt SerpinA1-antistof. SerpinA1-protein blev set i både leveren (figur 3(c)) og lungerne (figur 3(d)). Det sinusformede fordelingsmønster for SerpinA1-proteinekspression i leveren indikerer, at SerpinA1-protein sandsynligvis udskilles i blodet af hepatocytter.

(c)(string)

div>

(d)(d)

(a)(a)

(a) (B)
(b) (redet)
(d)
(d)

in vivo human serpina1 mRNA bidfordeling i leveren (A) og lungerne(b) af vægt mippa 24 timer efter i.v. blev afgiftet modsat ish. Røde prikker i billedet repræsenterer mRNA. SerpinA1-protein blev visualiseret i lever (C) og lunger (d) af IHC.

4. Diskussion

AATD er en ødelæggende sygdom med behov for effektive terapier til gavn for patienterne. Nuværende augmentationsterapi er utilstrækkelig til at undgå langvarig skade på leveren hos aatd-patienter. I øjeblikket forfølger mange grupper nye modaliteter for at give meget nødvendige terapier såsom genterapi. For eksempel er knoglemarvsafledt stamcelletransplantation blevet testet i aatd-mus og demonstreret en vis redning af hepatocytforringelse . Genudskiftningsstrategier testes også i klinikken, hvor et vægt SERPINA1-gen indsættes i leveren og udtrykker det passende SerpinA1-protein. Nuværende metoder skal stadig optimeres, og AAV-medieret genafgivelse kan forårsage antistofmedieret fald i proteinsekretion eller en immunologisk reaktion på det virale kapsid.

vi vurderede effekten af forbigående ekspression af SERPINA1 mRNA i muselever, da mRNA-levering til leveren er relativt ligetil og etableret via lipid nanopartikler (LNP), og vi kan administrere LNP-indkapslet mRNA uden signifikante immunreaktioner. Oprindeligt testede vi vores hypotese i aatd-patientfibroblaster og patientfibroblastafledte primære hepatocytter. Vores data viser tydeligt, at vi kan kode SERPINA1 med mRNA og efterfølgende udtrykke SerpinA1-protein fra begge celletyper. Vi demonstrerer også, at SerpinA1-protein udskilles fra disse celler, og proteinniveauer kan måles i supernatanten/cellekulturmediet. Dette indebærer, at det mRNA-kodede SerpinA1-protein foldes og modificeres passende i cellen for at muliggøre sekretion ud af ER og ind i cellekulturmediet, hvilket er et centralt træk ved denne mRNA-terapi. Ved hjælp af mRNA-terapi kan vi udnytte kroppens egne celler som en fabrik til at syntetisere protein, posttranslationally ændre det og endelig udskille det i blodstrømmen. Foreløbig analyse af cellekulturmedium indikerer, at den udskilte SerpinA1 er aktiv i en neutrofil elastaseinhiberingsanalyse (data ikke vist). Vores data i Figur 1, 2 og 3 antyder, at niveauerne af SerpinA1-protein er signifikant højere end baseline-eller negative kontrolniveauer. Disse niveauer bør være tilstrækkelige til at nedsætte neutrofil elastaseaktivitet i plasma og lungerne og derved forhindre alveolær nedbrydning og emfysem, som er karakteristiske for aatd.

vi udvidede vores undersøgelser for at afgøre, om mRNA-kodet SERPINA1 kunne udtrykkes in vivo. Vores undersøgelser viser, at intravenøst injiceret humant SERPINA1 mRNA nåede både leveren og lungerne i VÆGTMUS (figur 3(A) og 3(b)). Således kunne lipidindkapslet mRNA-behandling potentielt målrette mod begge steder af AATD (lever og lunge). Endnu vigtigere blev humant SerpinA1-protein produceret i både lever og lunger hos VÆGTMUS (figur 3(c) og 3(d)). SerpinA1 – proteinekspressionsmønsteret i leveren sinusoider indikerer, at proteiner udskilles af hepatocytterne eller en anden levercelletype, såsom stellatceller, der normalt udtrykker SERPINA1. Vores data kan ikke udelukke muligheden for, at mRNA kommer ind eller udtrykkes af andre leverceller udover hepatocytter, og dette vil kræve yderligere arbejde. Det er muligt, at humant SerpinA1-protein i lungerne kan komme fra to kilder: SERPINA1-mRNA ‘ et, der nåede lungerne via IV-injektion, såvel som det udskillede humane SerpinA1 produceret af humant SERPINA1-mRNA i leveren. I begge tilfælde er potentialet for SerpinA1-proteinekspression og lokalisering i lungerne og leveren lovende, da det kan blokere neutrofil elastase-medieret skade i lungerne, mens det muligvis mindsker formerne i leveren. Sidstnævnte hypotese er baseret på undersøgelserne fra Karadagi et al. hvor en stigning i SerpinA1-protein ved augmentationsterapi viste et fald i PBS-form i aatd patient PBMC. Dette rejser muligheden for, at mRNA-kodet SerpinA1-protein, når det udtrykkes i leveren, kan nedsætte leverproduktionen af PESS-formen og efterfølgende hæmme leverfibrose. Hæmning af leverfibrose og ER-stress kan i sidste ende reducere/eliminere aatd-patientens behov for en levertransplantation. Vores hypotese skal testes in vivo i en aatd-model, der demonstrerer leverfibrose og progression til hepatocellulært carcinom.

selvom disse er spændende data, vil vi gerne påpege, at mRNA-terapier skal forbedres for potentielt at give kronisk fordel for aatd-patienter. Nuværende halveringstider for eksogent leveret mRNA er typisk 24-48 timer i væv, mens proteinhalveringstider varierer afhængigt af proteinet og dets nedbrydningsmekanismer. Strategier til at øge halveringstiden for mRNA ‘er undersøges i øjeblikket, og tidlige data indikerer, at vi kan øge varigheden af mRNA-stabilitet ved at modulere UTR’ erne, der flankerer det kodonoptimerede mRNA . Rationelle proteintekniske strategier er også målrettet mod at lette øget proteinhalveringstid, hvilket resulterer i øget aktivitet og i sidste ende et nedsat behov for dosering af mRNA-terapi . Disse nye forbedringer kan resultere i en mRNA-behandling, der doseres sjældent og opretholder tilstrækkelig aktivitet, f.eks. Et andet aspekt, der ville forbedre mRNA-terapier, er sikkerheden ved LNP-levering, hvorved vi kan dosere LNPs hvert par uger. Nuværende LNP-teknologi letter et doseringsregime en gang om måneden, men understøtter ikke en hyppigere dosering, hvis vi parrer dosering med effektivitet. Som tidligere nævnt kan LNP-indkapslede mRNA-terapier omdoseres, i modsætning til nogle AAV-genterapier, og dosis kan titreres for at give maksimal patientfordel.

5. Konklusion

vores undersøgelser præsenterer potentialet for en ny terapeutisk modalitet, mRNA-terapi, hvorved et manglende eller ikke-funktionelt protein kan erstattes for at udføre normale funktioner. Vores fund viser, at lipidindkapslet mRNA kan målrettes mod lunge og lever, som er de to primære sygdomssteder i aatd. Mens tidligere undersøgelser, der undersøgte mRNA-terapi for AATD , har vist proteinekspression ved 24 timer i a549-og HEK293-celler, viser vores undersøgelser SerpinA1-proteinekspression i aatd-patientfibroblaster og patientafledte hepatocytter, som er relevante cellelinjer for sygdommen. Derudover udvider vi tidligere undersøgelser på dette område ved at demonstrere, at lipidindkapslet mRNA kan levere til muselever og lunge og producere SerpinA1-protein for at være funktionelt relevant for patienter. Yderligere forskning skal udføres i en aatd-sygdomsmodel og for at sikre sikkerheden ved multipel dosering af mRNA hos gnavere og højere dyr, inden denne modalitet overvejes til human brug. Samlet set rejser vores undersøgelser den interessante mulighed for, at mRNA-terapi ved hjælp af SERPINA1 mRNA kunne være gavnlig for aatd-patienter.

datatilgængelighed

alle data, der understøtter resultater offentliggjort i denne artikel, er præsenteret i artiklen. Der er ingen andre data tilgængelige.

interessekonflikter

alle forfattere er medarbejdere og aktionærer i ., et firma, der udvikler terapier til sjældne og ultrarare sygdomme.

forfatteres Bidrag

Brendan Connolly designet og udført cellekultur, transfektioner og in vivo prøvebehandling. Cleo Isaacs designet og udført IHC. Lei Cheng designet og udført ish eksperimenter, manuskript skrivning, og in vivo undersøgelser. Kirtika H. Asrani udførte vestlige blots, immunoassays og in vivo prøvebehandling. Romesh R. Subramanian designede eksperimenter, gennemgåede data og forfattet manuskript

anerkendelser

Aleksion Pharmaceuticals, Inc., er anerkendt for finansiering.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.