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ARNm SERPINA1 como Tratamiento para la deficiencia de Alfa-1 Antitripsina

Resumen

La deficiencia de Alfa-1-antitripsina (AAT) es un trastorno genético que produce AAT inactivo/defectuoso debido a mutaciones en el gen SERPINA1 que codifica AAT. Esta enfermedad está asociada con una disminución de la actividad de AAT en los pulmones y la deposición de proteína AAT defectuosa excesiva en el hígado. Actualmente no existe un tratamiento específico para la enfermedad hepática asociada con la deficiencia de AAT. La enfermedad pulmonar AAT a menudo se trata con uno de varios productos de reemplazo de proteínas séricas; sin embargo, no se dispone de estudios a largo plazo de la eficacia de la terapia de reemplazo de SerpinA1, que no reduce el daño hepático en la deficiencia de AAT. La terapia con ARNm podría llegar a afectar tanto al hígado como a los pulmones de los pacientes con deficiencia de AAT. Los fibroblastos de pacientes con AAT y los hepatocitos derivados de fibroblastos de pacientes con AAT se transfectaron con ARNm codificador de SERPINA 1 y se probaron medios de cultivo celular para determinar la expresión de SERPINA 1. Nuestros datos demuestran un aumento de la proteína SerpinA1 en medios de cultivo de fibroblastos de pacientes tratados con AAT y hepatocitos derivados de fibroblastos de pacientes tratados con AAT. Estudios in vivo en ratones salvajes demuestran la biodistribución de ARNm de SERPINA 1 en hígado y pulmones, así como la expresión de proteína de SERPINA 1 en estos dos órganos diana que están gravemente afectados en la deficiencia de AAT. En conjunto, nuestros datos sugieren que la terapia con ARNm SerpinA1 tiene el potencial de beneficiar a los pacientes que sufren de deficiencia de AAT.

1. Introducción

La deficiencia de alfa-1-antitripsina (DAAT) es una enfermedad devastadora con falta de terapias adecuadas. Las terapias actuales solo protegen los pulmones y, en casos avanzados, requieren inyecciones intravenosas frecuentes de proteína AAT derivada del plasma. Los pacientes con DAAT están predispuestos a padecer enfermedad pulmonar obstructiva y enfermedad hepática (por ejemplo, cirrosis y carcinoma hepatocelular en niños y adultos) . Se estima que aproximadamente el 1-5% de los pacientes con diagnóstico de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) tienen deficiencia de alfa-1-antitripsina . Aunque es extremadamente raro, se ha informado de enfisema en niños con DAAT y la incidencia de enfermedad hepática aumenta con la edad . Los síntomas graves se presentan más adelante en la vida, particularmente en los fumadores. Los síntomas hepáticos del DAAT se observan al final de la vida y, a menudo, requieren un trasplante de hígado. El DAAT es una enfermedad hereditaria causada por mutaciones en el gen SERPINA1 . El gen SERPINA1 tiene dos alelos designados como alelos M (los pacientes normales tienen un genotipo MM). El alelo más común que resulta en deficiencia grave de AAT se llama Z (E342K). Se ha notificado que el 95% de los pacientes con DAAT grave tienen un genotipo de ZZ y solo tienen entre el 10 y el 20% de los niveles séricos de SerpinA1 . En los casos de mutación ZZ, la proteína SerpinA1 no se puede plegar correctamente y no será secretada por los hepatocitos; por lo tanto, el DAAT no es causado por la incapacidad de producir proteínas, sino por la incapacidad de secretar proteínas funcionales. La acumulación de ZZ SerpinA1 en los hepatocitos provoca daños hepáticos graves . La PIZZA homocigota es bastante común y se produce en nacimientos de 1:2500-3000 en América del Norte y Europa.

La alfa-1-antitripsina (AAT), también conocida como SERPINA1 (inhibidor de la serina proteasa, grupo A, miembro 1), es una proteína secretada producida principalmente por hepatocitos y, en menor medida, por fagocitos mononucleares, neutrófilos y células epiteliales de las vías respiratorias/intestinales . SerpinA1 es una glicoproteína circulante que también es soluble en agua y difusible en los tejidos . El papel principal de la SerpinA1 es la regulación de la serina proteasa y el sitio principal de esta acción se encuentra en los pulmones. Allí, la Serpina 1 se une e inactiva la elastasa de neutrófilos, protegiendo así los tejidos alveolares de la degradación proteolítica durante las respuestas inflamatorias . La SerpinA1 es la antiproteasa circulante más abundante y las concentraciones plasmáticas normales de SerpinA1 suelen alcanzar 1-2 g / L .

El DAAT se caracteriza por la polimerización de proteínas SerpinA1 mal plegadas en el retículo endoplásmico rugoso de los hepatocitos, lo que disminuye la concentración y actividad de la SerpinA1 en la sangre y los tejidos . Para los pacientes con deficiencia grave, los niveles séricos de SerpinA1 están por debajo de 50 mg/dL, mientras que los niveles normales están en 200 mg/dL. Con niveles bajos de serpina circulante1, los pulmones no están protegidos de la elastasa de neutrófilos, una enzima que destruye los alvéolos y causa enfermedad pulmonar. Por lo tanto, las complicaciones clínicas más frecuentes del DAAT son el enfisema pulmonar y la enfermedad hepática .

Hasta la fecha, solo se dispone de terapia de aumento de TAA para el tratamiento del DAAT. La terapia de aumento de AAT se desarrolló en 1987 y actualmente solo está aprobada para uso comercial en pacientes seleccionados con enfisema pulmonar grave relacionado con el DAAT . El aumento de AAT solo ayuda a suministrar SerpinA1 a los pulmones, donde puede ayudar a prevenir el daño de la elastasa de neutrófilos. Dado que la deficiencia sérica no es la causa del daño hepático, no hay un tratamiento específico para los pacientes que sufren de enfermedad hepática asociada con DAAT. El único tratamiento es la atención de apoyo para la insuficiencia hepática típica y el trasplante de hígado para pacientes con cirrosis descompensada .

El DAAT es un trastorno monogénico que lo convierte en un objetivo ideal para la terapia de ARNm. El ARNm es una modalidad novedosa que es potencialmente aplicable para una amplia gama de enfermedades debido a su enorme flexibilidad sobre las terapias tradicionales biológicas y de reemplazo enzimático. Las terapias basadas en ARNm utilizan la maquinaria endógena de la célula huésped para la producción y modificación postraduccional de proteínas diana, lo que permite el desarrollo de terapias para enfermedades que antes no eran objetivo. Realizamos estudios in vitro e in vivo para determinar si podíamos expresar serpina codificada exógenamente 1 y dirigir el ARNm / proteína al órgano apropiado.

La terapia con ARNm podría dirigirse potencialmente tanto al hígado como a los pulmones de pacientes con deficiencia de AAT (a la espera de los experimentos actuales). Nuestros datos demostraron un aumento de la proteína SerpinA1 en medios de cultivo celular de fibroblastos de pacientes con AAT tratados, así como en los medios de cultivo celular de hepatocitos primarios derivados de fibroblastos de pacientes con AAT. Además, en animales con peso corporal que recibieron ARNm de SERPINA1 por inyección intravenosa, se observó que tanto el ARNm de SERPINA1 como la proteína SerpinA1 estaban localizados tanto en el hígado como en los pulmones. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que la expresión mediada por ARNm de la proteína SerpinA1 en los pulmones podría inhibir la elastasa de neutrófilos, mientras que podría promover la expresión de isoformas MM en el hígado y proporcionar múltiples rutas de beneficio para los pacientes con TAA.

2. Materiales y Métodos

2.1. Condiciones de Cultivo Celular de Fibroblastos de Pacientes con DAAT

. Los siguientes fibroblastos de pacientes se obtuvieron del Coriell Institute for Medical Research, Cell Repository (Camden, NJ): GM11423 y GM12445 del hígado del paciente con DAAT y GM02522 de la piel del paciente con DAAT y la línea normal de fibroblastos de control ND34769 de la piel. Las células se cultivaron en el medio Esencial Mínimo de Eagle con sales de Earle y aminoácidos no esenciales (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) suplementado con un 15% de suero fetal bovino e incubado a 37°C en un 5% de CO2.

Condiciones de Transfección. Los fibroblastos de los pacientes fueron transfectados con 2.5ug de cada ARNm y 4 µl de ARNm En reactivo de transfección de lípidos (MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD), en 3 experimentos independientes con 3 réplicas biológicas por experimento. Cada ARNm se diluyó a 2,5 µg en OptiMem (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) y se diluyó en OptiMem por pocillo un volumen similar de ARNm-In y se siguió el protocolo de acuerdo con la recomendación del fabricante. El ARNm diluido se mezcló con lípidos diluidos y se dejó incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de agregarlo a las células. Después de la adición de la mezcla de ARNm y lípidos a los fibroblastos de los pacientes, las células fueron devueltas a la incubadora a 37°C con 5% de CO2. Después de 24 horas, las células se lavaron suavemente con PBS dos veces y se lisaron en tampón RIPA fresco (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) con 1X inhibidores de proteasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lisis celular y cuantificación total de proteínas: Los lisados celulares de fibroblastos de los pacientes se recogieron en tubos de 0,5 mL (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y se centrifugaron a 18000 x g a 4°C para eliminar los residuos celulares. Después de la centrifugación, el sobrenadante transparente se transfirió cuidadosamente a un tubo etiquetado separado y se colocó en hielo. La concentración total de proteínas se determinó con un kit de ensayo de BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) por duplicado en formato de 96 pocillos de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Electroforesis Capilar Automatizada Wes para Expresión de SERPINA1. Las muestras finales de 5 µl cada una a una concentración de proteína de 0,4 mg/ml se prepararon siguiendo las instrucciones del fabricante de Protein Simple Wes. Los lisados se analizaron utilizando el sistema de electroforesis capilar basado en tamaño de proteína Simple Wes (ProteinSimple Wes; ProteinSimple, San José, CA). Las proteínas separadas por tamaño se probaron con anticuerpos específicos para SERPINA1 a una dilución de 1:125 (Novus NBP1-90309, Novus Biologics, Littleton, CO) y la tiorredoxina del ama de llaves a 1:1000 (CST 2429, Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), visualizado utilizando anticuerpos secundarios de conejo etiquetados y cuantificado utilizando el software del fabricante. Para cada carril, el área bajo la curva (AUC) de la SERPINA1 se normalizó al AUC del control de tiorredoxina.

2.2. Hepatocitos Deficientes en Alfa-1 Antitripsina

Condiciones de Cultivo Celular. Los hepatocitos derivados de pacientes con DAAT se generaron a partir de fibroblastos con DAAT por DefiniGen (Cambridge UK) utilizando un protocolo de diferenciación patentado. Las células se cultivaron en medios DTM y medios DRM (DefiniGen, Cambridge UK) y se platearon a 500.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos. Las células se cultivaron en condiciones hipóxicas a 37 ° C en 5% de CO2 y 5% de O2, y los medios se cambiaron cada dos días durante 10 días antes de la transfección según el protocolo propietario del fabricante (DefiniGen, Cambridge UK). Las células se cultivaron en condiciones hipóxicas según las instrucciones del fabricante, lo que permitió el crecimiento celular, mientras que las condiciones no hipóxicas redujeron el crecimiento celular.

Condiciones de Transfección y Expresión de Proteínas por ELISA. Los hepatocitos DAAT se transfectaron con 4ul de Lipofectamina ® 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) por 2.ARNm 5ug, en 3 experimentos independientes con 3 réplicas biológicas por experimento. Las células se incubaron durante 24, 48 y 72 horas antes de que se retiraran los medios de cultivo celular y se analizara la concentración de proteína SerpinA1 utilizando un ELISA de Abcam (Cambridge, MA) y siguiendo el protocolo del fabricante.

2.3. Estudios in Vivo

Todos los experimentos, alojamiento de animales, manipulación y procedimientos/protocolos experimentales fueron aprobados y realizados de acuerdo con Alexion Pharmaceuticals Inc. Directrices y reglamentos de la IACUC. En este estudio se utilizaron ratones macho C57BL / 6 (de 6 semanas de edad). Los ratones se mantuvieron en un ambiente de temperatura controlada con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas / 12 horas, con una dieta estándar y agua ad libitum.

Formulación de ARNm en Nanopartículas Lipídicas y Dosificación In Vivo. Las construcciones de ARNm se formularon utilizando una nanopartícula lipídica ionizable (LNP) autoensamblable que contenía ARNm SERPINA1. Se utilizó un ARNm de codificación GFP como control de vehículo cargado con ARNm y el PBS como control negativo en este experimento. Los LNPS se prepararon mezclando rápidamente el ARNm en tampón de acetato a pH 4.0 con una mezcla de lípidos, kit de ARNm Hepato9 (nanosistemas de precisión), suspendido en etanol a una proporción de lípidos a fármaco de ~11 (peso/peso). Se inyectó a los animales una dosis intravenosa única de 1,5 mg/kg de ARNm formulado a través de la vena de la cola. Los animales se sacrificaron 24 horas después de la inyección y los tejidos se fijaron y procesaron para la hibridación in situ (ISH) y la inmunohistoquímica (IHQ).

Recogida de Muestras y Preparación de Muestras FFPE. Se realizó necropsia a los animales y se colocó el lóbulo lateral izquierdo plano en casetes de tejido (Fisher Scientific). Los casetes se colocaron en un recipiente lleno de formalina neutra tamponada al 10%, solución fijadora NBF (Sigma) con una relación mínima de 1:20 de volumen de tejido frente a la solución fijadora. Se permitió que las muestras se fijaran durante un mínimo de 24 horas pero no más de 48 horas a temperatura ambiente. Después de la fijación del tejido, el casete se colocó en un recipiente lleno de PBS durante no más de 3 días. Después del lavado con PBS, los tejidos hepáticos se procesaron y se incrustaron en bloques de parafina.

2.4. Inmunohistoquímica e Hibridación In Situ

Se realizó inmunohistoquímica para SERPINA1 en secciones de tejido de 5 µm incrustadas en parafina fija con formalina utilizando un anticuerpo contra SERPINA1 (Atlas, HPA001292 a 1:100). La inmunotinción se realizó en la plataforma Leica BOND RX (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) de acuerdo con protocolos estándar con controles positivos apropiados. La recuperación de antígenos, estándar en la plataforma Leica BOND RX, utilizó la solución Leica ER1, EDTA-Tris, pH 8.0. Los portaobjetos se deshidrataron en una serie de etanol gradual, se eliminaron en xileno y se montaron con citoseal. Se tomaron imágenes de diapositivas utilizando el sistema VS120 con aumento de 40x (Olympus).

Para la visualización de ARNm, se realizó hibridación in situ (ISH). La sonda de hibridación in situ de ARN personalizada (Affymetrix, Santa Clara, CA) se diseñó para detectar el ARNm SERPINA1. El ensayo ISH de ARN automatizado se realizó utilizando el Kit de detección ViewRNA eZ-L (Affymetrix, Santa Clara, CA) y la plataforma Leica BOND RX (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL). Se prepararon tejidos fijos en formol e incrustados en parafina (FFPE) con un grosor de 5 um en portaobjetos de vidrio y se colocaron en el Leica BOND RX. El ensayo ViewRNA eZ-L se realizó de acuerdo con el protocolo manufactures, pero, brevemente, el ARN se desenmascaró con una incubación de 10 minutos a 95°C en la Solución de Recuperación de epítopos de Bond 1 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL), seguida de una incubación de 20 minutos con Proteinasa K del Kit de Pretratamiento de Enzimas de Bond a una dilución de 1:1000 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Se realizó hibridación con dilución de sonda SERPINA1 1:40 seguida de detección rápida. Para garantizar la integridad del ARN y el procedimiento de ensayo, también se hibridaron secciones adicionales con una sonda para la peptidil prolil isomerasa B (PPIB), una proteína de limpieza endógena utilizada como control positivo para la ISH. Para controlar la tinción inespecífica, se utilizó una sonda de control contra la proteína bacteriana dihidrodipicolinato reductasa (dapB) como control negativo. Todas las sondas estaban a una dilución de 1:40. Los portaobjetos se secaron al aire, se limpiaron en xileno y se montaron con citoseal. Se tomaron imágenes de diapositivas utilizando el sistema VS120 con aumento de 40x (Olympus).

3. Resultados

3.1. Expresión de SERPINA Humana Derivada de ARNM1 en Lisados Celulares y Medios Celulares de Fibroblastos de Pacientes y Hepatocitos Primarios Derivados de Fibroblastos de Pacientes

El ARNm de SERPINA humana 1 de TriLink se transfectó a fibroblastos de pacientes con DAAT, obtenido del Instituto Coriell. Se observó un aumento significativo de la expresión de proteína de serpina humana1 en lisados celulares (Figura 1(a)) y medios de cultivo celular (Figura 1(b)) tras la transfección de serpina de tipo salvaje (WT) o marcada con BANDERA (FT) 1.

(a)
(a)
(b)
(b)

(a)
(a)(b)
(b)

Figure 1
In vitro human SerpinA1 expression in cell lysates (a) and cell media (b) from AATD patient fibroblasts and normal skin fibroblasts. Vehicle control is GFP mRNA; WT-SERPINA1 is WT mRNA sequence; FT-SerpinA1 is flag-tagged mRNA sequence.

La transfección de ARNm de SERPINA HUMANA1 también se llevó a cabo en hepatocitos primarios derivados de fibroblastos obtenidos de DefiniGen. La secreción de la proteína WT SerpinA1 en el medio de cultivo aumentó a las 24 horas en comparación con el control de ARNm de GFP del vehículo solamente. Observamos un aumento constante de la expresión de la proteína SerpinA1 a lo largo del tiempo, como se observa a las 48 y 72 horas después de la transfección (Figura 2).

Figure 2
In vitro human SerpinA1 expression in cell culture media obtained from patient fibroblast-derived hepatocytes (DefiniGen, Cambridge UK).

3.2. In Vivo Human SerpinA1 Expression in WT Mice

Human SerpinA1 protein expression was subsequently evaluated in WT C57bl/6 mice. Se observó ARNm de SERPINA HUMANA1 en el hígado (Figura 3 (a)), como era de esperar, dado que el ARNm está encapsulado en una nanopartícula lipídica que generalmente transporta una gran cantidad de su carga al hígado. Un hallazgo intrigante fue que el ARNm de SERPINA 1 también se detectó en los pulmones de ratones (Figura 3(b)). La expresión de la proteína SerpinA1 se detectó utilizando un anticuerpo SerpinA1 específico para humanos. Se observó proteína SerpinA1 tanto en el hígado (Figura 3 (c)) como en los pulmones (Figura 3(d)). El patrón de distribución sinusoidal de la expresión de la proteína SerpinA1 en el hígado indica que la proteína SerpinA1 probablemente está siendo secretada a la sangre por los hepatocitos.

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(d)
en humanos in vivo serpina1 arnm biddistribution en el hígado(a) y de los pulmones(b) de la wt mippa 24 horas después que yo.v. fue detoxedted opuesto ISH. Los puntos rojos en la imagen representan el ARNm. La proteína SerpinA1 fue visualizada en hígado (c) y pulmones (d) por IHQ.

4. Discusión

El DAAT es una enfermedad devastadora que necesita terapias eficaces para beneficiar a los pacientes. La terapia de aumento actual es inadecuada para evitar daños a largo plazo en el hígado de los pacientes con DAAT. Actualmente, muchos grupos están buscando nuevas modalidades para proporcionar terapias muy necesarias, como la terapia génica. Por ejemplo, se ha probado el trasplante de células madre derivadas de médula ósea en ratones con DAAT y se ha demostrado cierto rescate del deterioro de los hepatocitos . Las estrategias de reemplazo de genes también se están probando en la clínica , donde se inserta un gen WT SERPINA1 en el hígado y expresa la proteína SerpinA1 apropiada. Los métodos actuales todavía necesitan ser optimizados y la entrega de genes mediada por AAV puede causar una disminución mediada por anticuerpos en la secreción de proteínas o una reacción inmunológica a la cápside viral.

Evaluamos el efecto de la expresión transitoria de ARNm de SERPINA 1 en el hígado de ratón, ya que la entrega de ARNm al hígado es relativamente sencilla y se establece a través de nanopartículas lipídicas (LNP), y podemos administrar ARNm encapsulado en LNP sin reacciones inmunitarias significativas. Inicialmente, probamos nuestra hipótesis en fibroblastos de pacientes con DAAT y hepatocitos primarios derivados de fibroblastos de pacientes. Nuestros datos demuestran claramente que podemos codificar SERPINA1 con ARNm y, posteriormente, expresar la proteína SerpinA1 de ambos tipos de células. También demostramos que la proteína SerpinA1 se secreta a partir de estas células y que los niveles de proteínas se pueden medir en el medio de cultivo sobrenadante/celular. Esto implica que la proteína SerpinA1 codificada en ARNm se pliega y modifica apropiadamente dentro de la célula para permitir la secreción fuera de la sala de emergencias y en el medio de cultivo celular, que es una característica clave de esta terapia de ARNm. Utilizando la terapia de ARNm, podemos utilizar las propias células del cuerpo como una fábrica para sintetizar proteínas, modificarlas postraductivamente y finalmente secretarlas en el torrente sanguíneo. El análisis preliminar del medio de cultivo celular indica que la serpina secretada 1 es enzimáticamente activa en un ensayo de inhibición de la elastasa de neutrófilos (no se muestran datos). Nuestros datos en las Figuras 1, 2 y 3 sugieren que los niveles de proteína SerpinA1 son significativamente más altos que los niveles basales o de control negativo. Estos niveles deben ser suficientes para disminuir la actividad de la elastasa de neutrófilos en el plasma y los pulmones y, por lo tanto, prevenir la degradación alveolar y el enfisema, que son característicos del DAAT.

Ampliamos nuestros estudios para determinar si la SERPINA1 codificada en ARNm podía expresarse in vivo. Nuestros estudios demuestran que el ARNm de SERPINA1 humano inyectado por vía intravenosa llegó tanto al hígado como a los pulmones en ratones con peso corporal (Figuras 3(a) y 3(b)). Por lo tanto, la terapia con ARNm encapsulado en lípidos podría dirigirse potencialmente a ambos sitios de DAAT (hígado y pulmón). Más importante aún, la proteína SerpinA1 humana se produjo tanto en el hígado como en los pulmones de los ratones con peso corporal (Figuras 3(c) y 3(d)). El patrón de expresión de la proteína SerpinA1 en los sinusoides hepáticos indica que las proteínas están siendo secretadas por los hepatocitos u otro tipo de células hepáticas, como las células estrelladas que normalmente expresan SERPINA1. Nuestros datos no pueden descartar la posibilidad de que el ARNm entre o sea expresado por otras células hepáticas además de los hepatocitos, y esto necesitará más trabajo. Es posible que la proteína SerpinA1 humana en los pulmones provenga de dos fuentes: el ARNm SERPINA1 que llegó a los pulmones a través de la inyección intravenosa, así como la SerpinA1 humana secretada producida por el ARNm SERPINA1 humano en el hígado. En cualquier caso, el potencial de expresión y localización de la proteína SerpinA1 en los pulmones y el hígado es prometedor, ya que podría bloquear el daño mediado por la elastasa de neutrófilos en los pulmones y posiblemente disminuir las formas de PIZZ en el hígado. Esta última hipótesis se basa en los estudios de Karadagi et al. en el que un aumento de la proteína SerpinA1 por terapia de aumento demostró una disminución en la forma de PIZZ en pacientes con DAAT PBMC. Esto plantea la posibilidad de que la proteína Serpina 1 codificada en ARNm, cuando se expresa en el hígado, pueda disminuir la producción hepática de la forma PIZZ y, posteriormente, inhibir la fibrosis hepática. La inhibición de la fibrosis hepática y el estrés en sala de emergencias podría, en última instancia, reducir/eliminar la necesidad de un trasplante de hígado del paciente con DAAT. Nuestra hipótesis debe probarse in vivo en un modelo de DAAT que demuestre fibrosis hepática y progresión a carcinoma hepatocelular.

Si bien estos son datos interesantes, nos gustaría señalar que las terapias de ARNm deben mejorarse para proporcionar un beneficio crónico potencial para los pacientes con DAAT. Las semividas actuales para el ARNm liberado exógenamente son típicamente de 24 a 48 h en el tejido, mientras que las semividas de las proteínas varían dependiendo de la proteína y sus mecanismos de degradación. Actualmente se están investigando estrategias para aumentar la vida media de los ARNm y los primeros datos indican que podemos aumentar la duración de la estabilidad del ARNm modulando las UTR que flanquean el ARNm optimizado para codones . Las estrategias de ingeniería de proteínas racionales también están dirigidas a facilitar el aumento de la vida media de las proteínas, lo que resulta en un aumento de la actividad enzimática y, en última instancia, en una menor necesidad de dosificación de la terapia de ARNm . Estas mejoras novedosas podrían dar lugar a una terapia de ARNm que se dosifica con poca frecuencia y mantiene la actividad enzimática suficiente, por ejemplo, de la proteína SerpinA1, para proporcionar una mejora clínica. Otro aspecto que mejoraría las terapias de ARNm es la seguridad de la entrega de LNP, por lo que podemos dosificar LNP cada pocas semanas. La tecnología LNP actual facilita un régimen de dosificación mensual, pero no admite una dosificación más frecuente si combinamos la dosificación con la eficacia. Como se mencionó anteriormente, las terapias de ARNm encapsuladas en LNP se pueden volver a dosificar, a diferencia de algunas terapias con genes AAV, y la dosis se puede ajustar para proporcionar el máximo beneficio para el paciente.

5. Conclusión

Nuestros estudios presentan el potencial de una nueva modalidad terapéutica, la terapia con ARNm, mediante la cual una proteína faltante o no funcional puede ser reemplazada para llevar a cabo funciones normales. Nuestros hallazgos demuestran que el ARNm encapsulado en lípidos puede dirigirse al pulmón y al hígado, que son los dos sitios principales de la enfermedad en el DAAT. Mientras que los estudios previos que exploraban la terapia de ARNm para el DAAT han demostrado la expresión de proteínas a las 24 horas en las células A549 y HEK293 , nuestros estudios demuestran la expresión de proteínas SerpinA1 en fibroblastos de pacientes con DAAT y hepatocitos derivados de pacientes, que son líneas celulares relevantes para la enfermedad. Además, ampliamos estudios previos en este campo demostrando que el ARNm encapsulado en lípidos puede llegar al hígado y pulmón de ratón y producir proteína SerpinA1 para ser funcionalmente relevante para los pacientes. Es necesario realizar más investigaciones en un modelo de enfermedad DAAT y garantizar la seguridad de la dosificación múltiple de ARNm en roedores y animales superiores antes de considerar esta modalidad para uso humano. En conjunto, nuestros estudios plantean la interesante posibilidad de que la terapia de ARNm utilizando ARNm SERPINA1 podría ser beneficiosa para los pacientes con DAAT.

Disponibilidad de datos

Todos los datos que respaldan los resultados publicados en este artículo se presentan en el artículo. No se dispone de otros datos.

Conflictos de intereses

Todos los autores son empleados y accionistas de Alexion Pharmaceuticals, Inc., una empresa que desarrolla terapias para enfermedades raras y ultrarrápidas.

Contribuciones de los autores

Brendan Connolly diseñó y llevó a cabo cultivos celulares, transfecciones y procesamiento de muestras in vivo. Cleo Isaacs diseñó y llevó a cabo IHC. Lei Cheng diseñó y llevó a cabo experimentos ISH, escritura de manuscritos y estudios in vivo. Kirtika H. Asrani realizó western blots, inmunoensayos y procesamiento de muestras in vivo. Romesh R. Subramanian diseñó experimentos, revisó datos y escribió manuscritos

Agradecimientos

Alexion Pharmaceuticals, Inc., se reconoce la financiación.

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