Articles

SERPINA1 mRNA alfa-1-antitrypsiinin puutoksen

Abstrakti

Alfa-1-antitrypsiinin (AAT) puutos on geneettinen häiriö, joka tuottaa inaktiivista/viallista AAT: ta AAT: ta koodaavan SERPINA1-geenin mutaatioiden vuoksi. Tähän sairauteen liittyy AAT: n vähentynyt aktiivisuus keuhkoissa ja liiallisen viallisen AAT-proteiinin Laskeuma maksassa. Tällä hetkellä ei ole erityistä hoitoa maksasairaus liittyy AAT puutos. Aatin keuhkosairautta hoidetaan usein yhdellä useista seerumiproteiinikorvaustuotteista; serpina1-korvaushoidon tehosta ei kuitenkaan ole pitkäaikaistutkimuksia, eikä se vähennä maksavaurioita aatin puutoksessa. mRNA-hoito voisi mahdollisesti kohdistua sekä AAT-puutospotilaiden maksaan että keuhkoihin. AAT – potilaan fibroblastit ja AAT-potilaan fibroblastiperäiset maksasolut transfektoitiin SERPINA1-koodaavalla mRNA: lla ja SerpinA1-ilmentymistä testattiin soluviljelmillä. Aineistomme osoittaa SerpinA1-proteiinin lisääntymistä viljelmissä hoidetuista AAT-potilaan fibroblasteista ja AAT-potilaan fibroblastiperäisistä hepatosyyteistä. In vivo-tutkimukset luonnonvaraisilla hiirillä osoittavat serpina1 mRNA biodistribuutiota maksassa ja keuhkoissa sekä SerpinA1-proteiinin ilmentymistä näissä kahdessa kohde-elimessä, joihin AAT: n puutos vaikuttaa kriittisesti. Yhteenlaskettuna tietomme viittaavat siihen, että SerpinA1 mRNA-hoito voi hyödyttää AAT-puutoksesta kärsiviä potilaita.

1. Johdanto

Alfa-1-antitrypsiinin puutos (AATD) on tuhoisa sairaus, johon ei ole riittäviä hoitoja. Nykyiset hoidot suojaavat vain keuhkoja, ja pitkälle edenneissä tapauksissa tarvitaan usein laskimonsisäisiä plasmasta johdetun AAT-proteiinin injektioita. AATD-potilaat ovat alttiita obstruktiiviselle keuhkosairaudelle ja maksasairaudelle (esim .kirroosille ja maksasolusyövälle lapsilla ja aikuisilla). Noin 1-5%: lla diagnosoitua keuhkoahtaumatautia (COPD) sairastavista potilaista arvioidaan olevan alfa-1-antitrypsiinin puutos . Vaikka emfyseema on erittäin harvinainen AATD-lapsilla, sitä on raportoitu ja maksasairauksien esiintyvyys lisääntyy iän myötä . Vakavia oireita ilmenee myöhemmin elämässä, erityisesti tupakoitsijoilla. AATD: n maksaoireet ilmenevät myöhäisiällä ja vaativat usein maksansiirtoa. AATD on serpina1-geenin mutaatioiden aiheuttama perinnöllinen sairaus . SERPINA1-geenissä on kaksi m-alleelia (normaaleilla potilailla on MM-genotyyppi). Yleisin vakavaan AAT-puutokseen johtava alleeli on nimeltään Z (E342K) . On raportoitu, että 95%: lla vaikeista AATD-potilaista on ZZ: n genotyyppi ja vain 10-20%: lla serpina1-pitoisuuksista seerumissa . ZZ-mutaation yhteydessä SerpinA1-proteiini ei pysty taittumaan kunnolla eikä erity maksasoluista; AATD ei siis johdu kyvyttömyydestä valmistaa proteiinia vaan kyvyttömyydestä erittää toiminnallista proteiinia. ZZ SerpinA1: n kertyminen maksasoluihin johtaa vakavaan maksavaurioon . Homotsygootti PIZZIA on melko yleinen ja sitä esiintyy 1:2500-3000 syntyneellä Pohjois-Amerikassa ja Euroopassa.

Alfa-1-antitrypsiini (AAT), joka tunnetaan myös nimellä SERPINA1 (seriiniproteaasin estäjä, ryhmä A, jäsen 1), on erittyvä proteiini, jota tuottavat pääasiassa maksasolut ja pienemmässä määrin mononukleaariset fagosyytit, neutrofiilit ja hengitysteiden / suoliston epiteelisolut . SerpinA1 on kiertävä glykoproteiini, joka on myös vesiliukoinen ja kudokseen diffusoituva . SerpinA1: n ensisijainen tehtävä on seriiniproteaasin säätely ja tämän vaikutuksen pääkohta on keuhkoissa. Siellä SerpinA1 sitoo ja inaktivoi neutrofiilien elastaasia suojaten siten alveolaarisia kudoksia proteolyyttiseltä hajoamiselta tulehdusreaktioiden aikana . SerpinA1 on verenkierrossa runsain anti-proteaasi, ja SerpinA1: n normaali pitoisuus plasmassa on yleensä 1-2G/L .

AATD: lle on ominaista huonosti soluttuneiden SerpinA1-proteiinien polymeroituminen maksasolujen karkeassa endoplasmaisessa retikulumissa, mikä vähentää SerpinA1: n pitoisuutta ja aktiivisuutta veressä ja kudoksissa . Potilailla, joilla on vaikea puutos, serpina1-pitoisuus seerumissa on alle 50 mg/dL, kun taas normaalitasot ovat 200 mg/dL. Kun verenkierrossa SerpinA1-pitoisuus on pieni, keuhkot eivät ole suojassa neutrofiilielastaasilta, entsyymiltä, joka tuhoaa keuhkorakkuloita ja aiheuttaa keuhkosairauksia. Siksi AATD: n yleisimmät kliiniset komplikaatiot ovat keuhkolaajentuma ja maksasairaus .

toistaiseksi AATD: n hoitoon on saatavilla vain AAT-augmentaatiohoitoa. AAT augmentation-hoito kehitettiin vuonna 1987, ja se on tällä hetkellä hyväksytty kaupalliseen käyttöön vain valikoiduilla potilailla, joilla on vaikea AATD: hen liittyvä keuhkolaajentuma . AAT augmentation auttaa vain toimittamaan SerpinA1 keuhkoihin, jossa se voi auttaa estämään neutrofiilien elastaasivaurioita. Koska seerumin puutos ei ole syy maksavaurioon, ei ole erityistä hoitoa potilaille, jotka kärsivät AATD: hen liittyvästä maksasairaudesta. Ainoa hoito on oireenmukainen hoito tyypillisessä maksan vajaatoiminnassa ja maksansiirto potilailla, joilla on dekompensoitunut kirroosi .

AATD on monogeeninen häiriö, joka tekee siitä ihanteellisen kohteen mRNA-hoidolle. mRNA on uusi modaalisuus, jota voidaan soveltaa moniin sairauksiin, koska se on erittäin joustava perinteisiin biologisiin ja entsyymikorvaushoitoihin verrattuna. mRNA-pohjaiset terapeutit hyödyntävät isäntäsolun endogeenista koneistoa kohdeproteiinien tuottamiseen ja translaation jälkeiseen muokkaamiseen, mikä mahdollistaa terapeutiikan kehittämisen sairauksiin, joita ei ole aiemmin kohdennettu. Teimme in vitro-ja In vivo-tutkimuksia selvittääksemme, voisimmeko ilmaista eksogeenisesti koodattua SerpinA1: tä ja kohdistaa mRNA/proteiini sopivaan elimeen.

mRNA-hoito voi mahdollisesti kohdistua sekä AAT-puutoksesta kärsivien potilaiden maksaan että keuhkoihin (nykyisiä kokeita odotettaessa). Aineistomme osoitti serpina1-proteiinin lisääntymistä hoidettujen AAT – potilaan fibroblastien soluviljelyalustoissa sekä AAT-potilaan fibroblastipohjaisten primaaristen hepatosyyttien soluviljelyalustoissa. Lisäksi suonensisäisesti serpina1 mRNA-valmistetta saaneilla eläimillä havaittiin sekä SERPINA1 mRNA-että SerpinA1-proteiinia sekä maksassa että keuhkoissa. Yhteenlaskettuna tietomme viittaavat siihen, että serpina1-proteiinin mRNA-välitteinen ilmentyminen keuhkoissa voisi estää neutrofiilien elastaasia, kun taas se voisi edistää MM-isoformin ilmentymistä maksassa ja tarjota useita hyötyreittejä AAT-potilaille.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. AATD – potilaiden fibroblastien

Soluviljelyolosuhteet. Seuraavat potilaiden fibroblastit saatiin Coriell Institute for Medical Research, Cell Repository (Camden, NJ) – tutkimuskeskuksesta: GM11423 ja GM12445 AATD – potilaan maksasta ja GM02522 AATD – potilaan ihosta ja normaali kontrollifibroblastilinja ND34769 iholta. Soluja kasvatettiin Eaglen minimaalisessa välttämättömässä väliaineessa Earlen suoloilla ja epäolennaisilla aminohapoilla (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) täydennettynä 15% sikiäimen seerumilla ja inkuboituna 37°C: ssa 5% CO2: ssa.

verensiirto-olosuhteet. Potilaiden fibroblasteille tehtiin transfektio 2.5ug kutakin mRNA: ta ja 4 µl mRNA: ta-lipiditransfektioreagenssia (MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD) 3 riippumattomassa kokeessa, joissa 3 biologista toisintoa koetta kohti. Jokainen mRNA laimennettiin 2,5 µg: iin OptiMEM-liuoksessa (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) ja vastaavasti sopiva määrä mRNA-Iniä laimennettiin Optimemilla kuoppaa kohti ja protokollaa noudatettiin valmistajan suosituksen mukaisesti. Laimennettu mRNA sekoitettiin laimennettuun lipidiin ja sen annettiin inkuboitua 15 minuuttia huoneenlämmössä ennen solujen lisäämistä. Kun potilaiden fibroblasteihin oli lisätty mRNA-lipidiseosta, solut palautettiin inkubaattoriin 37°C: ssa, jossa oli 5% CO2: ta. 24 tunnin kuluttua solut pestiin varovasti PBS: llä kahdesti ja lysättiin tuoreeseen RIPA-puskuriin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 1-kertaisella proteaasinestäjällä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

solujen hajoaminen ja kokonaisproteiinin kvantifiointi: potilaan fibroblastisolulysaatit kerättiin 0, 5 mL: n putkiin (Eppendorf, Hampuri, Saksa) ja sentrifugoitiin 18000 x g: n lämpötilaan 4°C: ssa solujätteiden poistamiseksi. Sentrifugoinnin jälkeen kirkas supernatantti siirrettiin varovasti erilliseen merkittyyn putkeen ja asetettiin jäälle. Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin BCA-määrityssarjalla (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) kahtena kappaleena 96-kuoppaisessa muodossa valmistajan protokollan mukaan.

Wes automatisoi Kapillaarielektroforeesin SERPINA1-ekspressiota varten. Lopulliset 5 µl: n näytteet kukin 0, 4 mg/mL proteiinipitoisuudella valmistettiin Protein Simple Wes-valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lysaatit analysoitiin käyttämällä Protein Simple Wes-kokoon perustuvaa kapillaarielektroforeesijärjestelmää (ProteinSimple Wes; ProteinSimple, San Jose, CA). Kokoerotetut proteiinit testattiin serpina1-spesifisillä vasta-aineilla 1:125 laimennuksessa (Novus NBP1-90309, Novus Biologics, Littleton, CO) ja taloudenhoitaja Tioredoxin 1:1000: ssa (CST 2429, Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), visualisoidaan käyttäen merkittyjä kanin sekundaarisia vasta-aineita ja kvantitoidaan valmistajan ohjelmiston avulla. Serpina1: n käyrän alle jäävä pinta-ala (AUC) normalisoitiin kunkin kaistan osalta Tioredoksiinikontrollin AUC: ksi.

2, 2. Alfa-1 antitrypsiinin puute maksasoluissa

soluviljelmissä. Aatd potilaan johdetut maksasolut on tuotettu AATD fibroblasteista DefiniGen (Cambridge UK) käyttäen omaa erilaistumisprotokollaa. Soluja kasvatettiin DTM-medioissa ja DRM-medioissa (DefiniGen, Cambridge UK) ja pinnoitettiin 500 000 solua kaivoa kohti 24-kaivolevyllä. Soluja kasvatettiin hypoksisissa olosuhteissa 37°C: ssa 5% CO2: ssa ja 5% O2: ssa, ja väliainetta vaihdettiin kahden päivän välein 10 päivän ajan ennen verensiirtoa valmistajan laatiman protokollan (DefiniGen, Cambridge UK) mukaisesti. Soluja kasvatettiin valmistajan ohjeiden mukaan hypoksisissa olosuhteissa, mikä mahdollisti solujen kasvun, kun taas ei-hypoksiset olosuhteet vähensivät solujen kasvua.

Transfektiotilanne ja proteiinin ilmentyminen ELISA-menetelmällä. AATD hepatosyyttien transfektoitiin 4ul Lipofectamine® 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) per 2.5ug mRNA, 3 itsenäisessä kokeessa 3 biologista kopiota per koe. Soluja inkuboitiin 24, 48 ja 72 tuntia ennen kuin soluviljelmäaine poistettiin ja määritettiin SerpinA1-proteiinipitoisuuden määrittämiseksi ABCAM: n (Cambridge, MA) ELISA-menetelmällä ja valmistajan protokollaa noudattaen.

2, 3. In Vivo-tutkimukset

kaikki kokeet, eläinsäilytys, käsittely ja kokeelliset menettelyt/protokollat hyväksyttiin ja tehtiin Alexion Pharmaceuticals Inc: n mukaisesti. IACUC: n ohjeet ja määräykset. C57bl / 6 uroshiirtä (6 viikon ikäisiä) käytettiin tässä tutkimuksessa. Hiiriä pidettiin lämpötilasäädellyssä ympäristössä, jossa oli 12-h/12-h vaalea-tumma jakso, jossa oli normaali ruokavalio ja vettä ad libitum.

mRNA: n formulointi Lipidinanohiukkasiin ja In Vivo-annostelu. mRNA-konstruktiot muotoiltiin käyttäen ITSEKOKOONTUVAA ionisoituvaa lipidinanopartikkelia (LNP), joka sisältää SERPINA1 mRNA: ta. MRNA: ta koodaavaa GFP: tä käytettiin tässä kokeessa mRNA: ta kuormittavana ajoneuvokontrollina ja PBS: ää negatiivisena kontrollina. LNP: t valmistettiin sekoittamalla nopeasti mRNA: ta asetaattipuskuriin pH 4: ssä.0, jossa on lipidiseos, Hepato9 mRNA kit (Precision NanoSystems), suspendoitu etanoliin lipidi-lääkesuhteessa ~11 (wt/wt). Eläimille annettiin laskimonsisäinen kerta-annos 1, 5 mg/kg formuloitua mRNA: ta pyrstölaskimoon. Eläimet lopetettiin 24 tunnin kuluttua injektiosta ja kudokset kiinnitettiin ja käsiteltiin in situ-hybridisaatiota (ISH) ja immunohistokemiaa (IHC) varten.

näytteenotto ja FFPE-näytteen valmistelu. Eläimille tehtiin ruumiinavaus, ja vasen lateraalilohko laitettiin tasaiseksi kudoskasetteihin (Fisher Scientific). Tämän jälkeen kasetit laitettiin säiliöön, joka oli täytetty 10-prosenttisella neutraalilla Puskuroidulla formaliinilla, NBF (Sigma) – fiksatiiviliuoksella, jossa kudostilavuuden suhde fiksatiiviliuokseen oli vähintään 1:20. Näytteiden annettiin kiinnittyä vähintään 24 tunnin mutta enintään 48 tunnin ajan huoneenlämmössä. Kudoskiinnityksen jälkeen kasetti asetettiin PBS: llä täytettyyn astiaan enintään 3 päiväksi. PBS: n pesun jälkeen maksakudokset prosessoitiin ja upotettiin parafiinilohkoihin.

2, 4. Immunohistokemia ja In Situ Hybridisaatiomenetelmät

immunohistokemia SERPINA1:lle suoritettiin formaliini-kiinteällä parafiiniin upotetulla 5 µm: n kudososalla käyttäen serpina1-vasta-ainetta (Atlas, HPA001292 klo 1: 100). Immunostisointi suoritettiin Leica BOND RX-alustalla (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) vakioprotokollien mukaisesti asianmukaisilla positiivisilla kontrolleilla. Antigeenin nouto, standardi Leica BOND RX-alustalla, käytti Leica ER1, EDTA-Tris, pH 8.0-ratkaisua. Liukumäet dehydratoitiin lajiteltuun etanolisarjaan, puhdistettiin ksyleenillä ja asennettiin Sytoseaalilla. Diat kuvattiin Vs120-järjestelmällä 40x suurennoksella (Olympus).

mRNA-visualisoinnille tehtiin in situ hybridisaatio (Ish). Custom RNA in situ hybridisaatio luotain (Affymetrix, Santa Clara, CA) on suunniteltu havaitsemaan SERPINA1 mRNA. Automatisoitu RNA ISH-määritys suoritettiin käyttäen ViewRNA eZ-L Detection Kit-laitetta (Affymetrix, Santa Clara, CA) ja Leica BOND RX-alustaa (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) käytettiin. Formaliinikiinteät, parafiiniin upotetut kudokset (FFPE) valmistettiin 5 um: n paksuisina lasilevyille ja laitettiin Leica-sidokseen RX. ViewRNA eZ-L-määritys suoritettiin manufactures protocol-menetelmän mukaisesti, mutta lyhyesti RNA:ta tutkittiin 10 minuutin inkubaatiolla 95°C: ssa Bond Epitope Retrieval Solution 1: ssä (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL), minkä jälkeen se inkuboitiin 20 minuutin inkubaatiolla proteinaasi K: lla Bond-entsyymin Esikäsittelypaketista 1: 1000-laimennuksessa (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Hybridisaatio suoritettiin SERPINA1 1: 40-luotaimen laimennuksella, jota seurasi FastRed-tunnistus. RNA: n eheyden ja määritysmenetelmän varmistamiseksi lisäosia hybridisoitiin myös peptidyyliprolyyli-isomeraasi B: n (ppib) koettimella, joka on endogeeninen sisäsiittoinen proteiini, jota käytetään ISH: n positiivisena kontrollina. Epäspesifisen värjäyksen torjuntaan käytettiin negatiivisena kontrollina kontrollianturia bakteeriproteiinidihydrodipikolinaattireduktaasia (dapB) vastaan. Kaikki luotaimet olivat 1: 40 laimennuksessa. Diat ilmakuivattiin, puhdistettiin ksyleenillä ja asennettiin Sytoseaalilla. Diat kuvattiin Vs120-järjestelmällä 40x suurennoksella (Olympus).

3. Tulokset

3.1. mRNA-johdettu ihmisen SerpinA1-ilmentymä potilaiden fibroblastien Solulysaateissa ja Soluväliaineissa ja potilaan Fibroblastista johdetuissa primaarisissa maksasoluissa

ihmisen Serpina1 mRNA Trilinkistä siirrettiin CORIELL-instituutista saatuun AATD-potilaan fibroblasteihin. Ihmisen SerpinA1-proteiiniekspression havaittiin lisääntyvän merkittävästi solujen Lysaateissa(Kuva 1 a) ja soluviljelyaineissa (Kuva 1 b), kun joko villityyppistä(WT) tai lipulla merkittyä (FT) SerpinA1: tä siirrettiin.

(a)
(a)
(b)
(b)

(a)
(a)(b)
(b)

Figure 1
In vitro human SerpinA1 expression in cell lysates (a) and cell media (b) from AATD patient fibroblasts and normal skin fibroblasts. Vehicle control is GFP mRNA; WT-SERPINA1 is WT mRNA sequence; FT-SerpinA1 is flag-tagged mRNA sequence.

ihmisen SERPINA1 mRNA-transfektio tehtiin myös potilaille, jotka saivat definigenistä fibroblastista johdettuja primaarisia maksasoluja. WT SerpinA1-proteiinin eritys viljelyaineeseen lisääntyi 24 tunnin kuluttua verrattuna ainoastaan GFP mRNA-kontrolliin. Havaitsimme serpina1-proteiiniekspression jatkuvaa lisääntymistä ajan mittaan, kun se nähtiin 48 tunnin ja 72 tunnin kuluttua verensiirrosta (kuva 2).

Figure 2
In vitro human SerpinA1 expression in cell culture media obtained from patient fibroblast-derived hepatocytes (DefiniGen, Cambridge UK).

3.2. In Vivo Human SerpinA1 Expression in WT Mice

Human SerpinA1 protein expression was subsequently evaluated in WT C57bl/6 mice. Ihmisen SERPINA1 mRNA: ta havaittiin maksassa(kuva 3 a), kuten voidaan olettaa, koska mRNA on kapseloitu lipidinanohiukkaseen, joka yleensä kuljettaa suuren määrän lastiaan maksaan. Mielenkiintoinen havainto oli, että serpina1 mRNA havaittiin myös hiirten keuhkoissa (kuva 3(b)). SerpinA1-proteiinin ilmentyminen havaittiin käyttämällä ihmiselle spesifistä SerpinA1-vasta-ainetta. SerpinA1-proteiinia havaittiin sekä maksassa(kuva 3 (c)) että keuhkoissa(kuva 3 (d)). Serpina1-proteiinin ilmentymisen sinimuotoinen jakautumistapa maksassa osoittaa, että serpina1-proteiinia erittyy todennäköisesti maksasolujen kautta vereen.

(b)

(c)(string)

div>

(d)(d)

(a)
(a) (B)
(b)(redet)
(d)
(d)
in vivo ihmisen serpina1 mRNA biddistribuutio maksassa(A) ja keuhkoissa(B) wt mippa 24h: n 24h: n jälkeen vieroitettiin Ish: ta vastapäätä. Kuvassa olevat punaiset pisteet esittävät mRNA: ta. IHC visualisoi serpina1-proteiinin maksassa (c) ja keuhkoissa (d).

4. Keskustelu

AATD on tuhoisa sairaus, johon tarvitaan tehokkaita hoitoja potilaiden hyödyksi. Nykyinen augmentation-hoito on riittämätön estämään pitkäaikaisia vaurioita AATD-potilaiden maksassa. Tällä hetkellä monet ryhmät pyrkivät uusia tapoja tarjota paljon kaivattuja hoitoja, kuten geeniterapiaa. Esimerkiksi luuytimestä johdettua kantasolusiirtoa on testattu AATD-hiirillä, ja se on osoittanut jonkin verran pelastusta maksasolujen heikkenemisestä . Klinikalla testataan myös geeninvaihtostrategioita, joissa WT SERPINA1-geeni työnnetään maksaan ja ilmentää sopivaa SerpinA1-proteiinia. Nykyiset menetelmät on vielä optimoitava, ja AAV-välitteinen geenitoimitus voi aiheuttaa vasta-ainevälitteisen vähenemisen proteiinin erityksessä tai immunologisen reaktion viruksen kapsidiin.

arvioimme serpina1 mRNA: n ohimenevän ilmentymisen vaikutusta hiiren maksassa, koska mRNA: n toimitus maksaan on suhteellisen suoraviivaista ja vakiintuu lipidinanohiukkasten (LNP) kautta, ja voimme antaa LNP-kapseloitua mRNA: ta ilman merkittäviä immuunireaktioita. Aluksi testasimme hypoteesiamme aatd-potilaan fibroblasteilla ja potilaan fibroblastiperäisillä primaarisilla hepatosyyteillä. Datamme osoittaa selvästi, että voimme koodata SERPINA1: tä mRNA: lla ja myöhemmin ilmaista SerpinA1-proteiinia molemmista solutyypeistä. Osoitamme myös, että SerpinA1-proteiinia erittyy näistä soluista ja proteiinitasot voidaan mitata supernatantista/soluviljelyaineesta. Tämä merkitsee sitä, että mRNA-koodattu SerpinA1-proteiini taitellaan ja muunnetaan asianmukaisesti solun sisällä, jotta se voidaan erittyä ER: stä soluviljelyaineeseen, mikä on tämän mRNA-hoidon keskeinen ominaisuus. MRNA-hoidon avulla voimme hyödyntää elimistön omia soluja tehtaana syntetisoidaksemme proteiinia, muuntaaksemme sitä translationaalisesti ja erittääksemme sen lopulta verenkiertoon. Soluviljelyaineen alustava analyysi osoittaa, että erittyvä SerpinA1 on entsymaattisesti aktiivinen neutrofiilien elastaasin estotestissä (tietoja ei näy). Lukujen 1, 2 ja 3 tiedot viittaavat siihen, että SerpinA1-proteiinin tasot ovat merkittävästi korkeammat kuin lähtötason tai negatiivisen kontrollin tasot. Näiden pitoisuuksien pitäisi riittää vähentämään neutrofiilien elastaasiaktiivisuutta plasmassa ja keuhkoissa ja siten estämään alveolaarisen hajoamisen ja keuhkolaajentuman, jotka ovat tyypillisiä AATD: lle.

laajensimme tutkimuksiamme selvittääksemme, voidaanko mRNA-koodattu SERPINA1 ilmaista in vivo. Tutkimuksemme osoittavat, että suonensisäisesti injisoitu ihmisen SERPINA1 mRNA pääsi WT-hiirillä sekä maksaan että keuhkoihin (kuvat 3(a) ja 3(b)). Näin ollen lipidikapseloitu mRNA-hoito voi mahdollisesti kohdistua molempiin AATD-kohtiin (maksaan ja keuhkoihin). Vielä tärkeämpää on, että ihmisen SerpinA1-proteiinia tuotettiin sekä WT-hiirten maksassa että keuhkoissa (kuvat 3(c) ja 3(d)). Serpina1-proteiinin ilmentymäkuvio maksan sinusoideissa osoittaa, että proteiineja erittävät maksasolut tai muu maksasolutyyppi, kuten stellaattisolut, jotka normaalisti ilmentävät SERPINA1: tä. Tietojemme perusteella ei voida sulkea pois mahdollisuutta, että mRNA tulee maksasolujen lisäksi myös muihin maksasoluihin tai ilmenee niistä, ja tämä vaatii lisätyötä. On mahdollista, että ihmisen serpina1-proteiini keuhkoissa voi olla peräisin kahdesta lähteestä: serpina1 mRNA: sta, joka pääsi keuhkoihin laskimonsisäisen injektion kautta, sekä ihmisen serpina1 mRNA: n erittämästä ihmisen serpina1: stä maksassa. Kummassakin tapauksessa serpina1-proteiinin ilmentymisen ja lokalisoinnin mahdollisuus keuhkoissa ja maksassa on lupaava, koska se voi estää neutrofiilien elastaasivälitteisen vaurion keuhkoissa samalla kun mahdollisesti vähentää PIZZIN muotoja maksassa. Jälkimmäinen hypoteesi perustuu Karadagi et al: n tutkimuksiin. jossa serpina1-proteiinin lisääntyminen augmentaatiohoidolla osoitti PIZZIN muodon vähenemisen AATD-potilaan PBMC: ssä. Tämä herättää mahdollisuuden, että mRNA-koodattu SerpinA1-proteiini, ilmaistuna maksassa, voisi vähentää PIZZIN muodon maksan tuotantoa ja myöhemmin estää maksafibroosia. Maksafibroosin esto ja ER-stressi voivat lopulta vähentää/poistaa AATD-potilaan maksansiirron tarpeen. Hypoteesimme on testattava in vivo AATD-mallilla, joka osoittaa maksafibroosin ja etenemisen maksasolusyöväksi.

vaikka nämä ovat jännittäviä tietoja, haluamme huomauttaa, että mRNA-hoitoja on parannettava, jotta AATD-potilaat voivat hyötyä kroonisesti. Eksogeenisesti toimitetun mRNA: n nykyiset puoliintumisajat kudoksessa ovat tyypillisesti 24-48h, kun taas proteiinin puoliintumisajat vaihtelevat proteiinin ja sen hajoamismekanismien mukaan. Strategioita mrnas: n puoliintumisajan lisäämiseksi tutkitaan parhaillaan, ja varhaiset tiedot osoittavat, että voimme lisätä mRNA: n pysyvyyttä moduloimalla UTR-arvoja kodonioptimoidun mRNA: n rinnalla . Rationaaliset proteiinisuunnittelustrategiat on myös suunnattu helpottamaan proteiinin puoliintumisajan pitenemistä, mikä johtaa entsymaattisen aktiivisuuden lisääntymiseen ja lopulta mRNA-hoidon tarpeen vähenemiseen . Nämä uudet parannukset voivat johtaa mRNA-hoitoon, jota annetaan harvoin ja joka ylläpitää riittävää entsyymiaktiivisuutta, esim.SerpinA1-proteiinia, kliinisen parannuksen aikaansaamiseksi. Toinen näkökohta, joka parantaisi mRNA-hoitoja, on LNP-annostelun turvallisuus, jolloin voimme annostella INP-annoksia muutaman viikon välein. Nykyinen LNP-tekniikka helpottaa kerran kuukaudessa tapahtuvaa annostelua, mutta se ei tue tiheämpää annostelua, jos annostelu yhdistetään tehokkuuteen. Kuten aiemmin mainittiin, LNP-kapseloidut mRNA-hoidot voidaan annostella uudelleen, toisin kuin jotkin AAV-geenihoidot, ja annosta voidaan titrata mahdollisimman suuren potilashyödyn saamiseksi.

5.

tutkimuksemme esittävät uuden terapeuttisen modaliteetin, mRNA-hoidon, potentiaalin, jossa puuttuva tai toimimaton proteiini voidaan korvata normaalien toimintojen suorittamiseksi. Löydöksemme osoittavat, että lipidikapseloitu mRNA voidaan kohdistaa keuhkoihin ja maksaan, jotka ovat AATD: n kaksi ensisijaista tautipaikkaa. Vaikka aikaisemmat tutkimukset , joissa tutkittiin AATD: n mRNA-hoitoa, ovat osoittaneet proteiinin ilmentymisen 24h: ssa a549-ja HEK293-soluissa, tutkimuksemme osoittavat SerpinA1-proteiinin ilmentymisen AATD-potilaan fibroblasteissa ja potilaasta johdetuissa maksasoluissa, jotka ovat taudin kannalta merkityksellisiä solulinjoja. Lisäksi laajennamme aiempia tutkimuksia tällä alalla osoittamalla, että lipidikapseloitu mRNA voi toimittaa hiiren maksaan ja keuhkoihin ja tuottaa SerpinA1-proteiinia, jotta se olisi toiminnallisesti merkityksellinen potilaille. Lisätutkimuksia on tehtävä AATD-tautimallilla ja jotta voidaan varmistaa mRNA: n toistuvan annostelun turvallisuus jyrsijöille ja korkeammille eläimille ennen kuin harkitaan tämän menetelmän käyttöä ihmisille. Yhdessä tutkimuksemme nostavat esiin mielenkiintoisen mahdollisuuden, että SERPINA1 mRNA: ta hyödyntävä mRNA-hoito voisi olla hyödyllistä AATD-potilaille.

tietojen saatavuus

kaikki tässä artikkelissa julkaistuja tuloksia tukevat tiedot on esitetty artikkelissa. Muita tietoja ei ole saatavilla.

eturistiriidat

kaikki tekijät ovat Alexion Pharmaceuticals, Inc: n työntekijöitä ja osakkeenomistajia., yritys, joka kehittää hoitoja harvinaisiin ja ultrarare sairauksiin.

tekijöiden osuus

Brendan Connolly suunnitteli ja toteutti soluviljelyn, transfektiot ja In vivo-näytteen käsittelyn. Cleo Isaacs suunnitteli ja toteutti IHC: n. Lei Cheng suunnitteli ja toteutti ISH-kokeita, Käsikirjoitusten kirjoittamista ja In vivo-tutkimuksia. Kirtika H. Asrani suoritti western blotteja, immunomäärityksiä ja In vivo-näytteen käsittelyä. Romesh R. Subramanian suunnitteli kokeita, tarkasteli tietoja ja laati käsikirjoituksen

kuittaukset

Alexion Pharmaceuticals, Inc., myönnetään rahoitusta.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.