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ARNm de SERPINA1 comme Traitement du déficit en Alpha-1 antitrypsine

Résumé

Le déficit en Alpha-1-antitrypsine (TAA) est une maladie génétique qui produit une TAA inactive / défectueuse due à des mutations du gène SERPINA1 codant pour la TAA. Cette maladie est associée à une diminution de l’activité de l’AAT dans les poumons et au dépôt d’une protéine AAT défectueuse excessive dans le foie. Il n’existe actuellement aucun traitement spécifique pour les maladies du foie associées à une carence en TAA. Les maladies pulmonaires AAT sont souvent traitées avec l’un des nombreux produits de remplacement des protéines sériques; cependant, des études à long terme de l’efficacité du traitement de remplacement de SerpinA1 ne sont pas disponibles et ne réduisent pas les lésions hépatiques en cas de carence en TAA. Le traitement par ARNm pourrait potentiellement cibler à la fois le foie et les poumons des patients déficients en ATA. Les fibroblastes des patients AAT et les hépatocytes dérivés des fibroblastes des patients AAT ont été transfectés avec l’ARNm codant pour SERPINA1 et des milieux de culture cellulaire ont été testés pour l’expression de SerpinA1. Nos données démontrent une augmentation de la protéine SerpinA1 dans les milieux de culture à partir de fibroblastes de patients traités par AAT et d’hépatocytes dérivés de fibroblastes de patients traités par AAT. Des études in vivo sur des souris de type sauvage démontrent la biodistribution de l’ARNm SERPINA1 dans le foie et les poumons, ainsi que l’expression de la protéine SerpinA1 dans ces deux organes cibles qui sont gravement affectés par une carence en TAA. Pris ensemble, nos données suggèrent que la thérapie par ARNm SerpinA1 a le potentiel de bénéficier aux patients souffrant d’un déficit en ATA.

1. Introduction

Le déficit en alpha-1-antitrypsine (DAA) est une maladie dévastatrice qui manque de traitements adéquats. Les thérapies actuelles ne protègent que les poumons et, dans les cas avancés, nécessitent des injections intraveineuses fréquentes de protéine AAT dérivée du plasma. Les patients atteints d’AATD sont prédisposés à une maladie pulmonaire obstructive et à une maladie du foie (par exemple, cirrhose et carcinome hépatocellulaire chez les enfants et les adultes). On estime qu’environ 1 à 5% des patients atteints d’une bronchopneumopathie chronique obstructive (MPOC) diagnostiquée présentent un déficit en alpha-1-antitrypsine. Bien qu’extrêmement rare, l’emphysème chez les enfants atteints de TCA a été rapporté et l’incidence de la maladie du foie augmente avec l’âge. Les symptômes graves surviennent plus tard dans la vie, en particulier chez les fumeurs. Les symptômes hépatiques de l’AATD sont observés tard dans la vie et nécessitent souvent une transplantation hépatique. L’AATD est une maladie héréditaire causée par des mutations au sein du gène SERPINA1. Le gène SERPINA1 possède deux allèles désignés comme des allèles M (les patients normaux ont un génotype MM). L’allèle le plus courant entraînant une carence sévère en AAT est appelé Z (E342K). Il a été rapporté que 95% des patients atteints d’AATD sévères ont un génotype de ZZ et n’ont que 10 à 20% des taux sériques de SerpinA1. En cas de mutation ZZ, la protéine SerpinA1 ne peut pas se replier correctement et ne sera pas sécrétée par les hépatocytes; par conséquent, l’AATD n’est pas causée par une incapacité à fabriquer des protéines mais par une incapacité à sécréter des protéines fonctionnelles. L’accumulation de ZZ SerpinA1 dans les hépatocytes entraîne de graves lésions hépatiques. Le PIZZ homozygote est assez commun et se produit dans 1: 2500-3000 naissances en Amérique du Nord et en Europe.

L’alpha-1-antitrypsine (AAT), également connue sous le nom de SERPINA1 (inhibiteur de la sérine protéase, groupe A, membre 1), est une protéine sécrétée produite principalement par les hépatocytes et dans une moindre mesure par les phagocytes mononucléaires, les neutrophiles et les cellules épithéliales des voies respiratoires / intestinales. SerpinA1 est une glycoprotéine circulante également soluble dans l’eau et diffusable dans les tissus. Le rôle principal de SerpinA1 est la régulation de la sérine protéase et le site principal de cette action se trouve dans les poumons. Là, SerpinA1 se lie et inactive l’élastase neutrophile, protégeant ainsi les tissus alvéolaires de la dégradation protéolytique lors des réponses inflammatoires. SerpinA1 est l’anti-protéase circulante la plus abondante et les concentrations plasmatiques normales de SerpinA1 atteignent généralement 1-2g /L.

L’AATD est caractérisée par la polymérisation des protéines SerpinA1 mal repliées dans le réticulum endoplasmique rugueux des hépatocytes, ce qui diminue la concentration et l’activité de SerpinA1 dans le sang et les tissus. Chez les patients présentant une carence sévère, les taux sériques de SerpinA1 sont inférieurs à 50 mg / dL alors que les taux normaux sont à 200 mg / dL. Avec de faibles niveaux de serpine circulante1, les poumons ne sont pas protégés de l’élastase neutrophile, une enzyme qui détruit les alvéoles et provoque des maladies pulmonaires. Par conséquent, les complications cliniques les plus fréquentes de l’AATD sont l’emphysème pulmonaire et les maladies du foie.

À ce jour, seule une thérapie d’augmentation de l’AAT est disponible pour le traitement de l’AATD. La thérapie d’augmentation de l’AAT a été développée en 1987 et n’est actuellement approuvée que pour une utilisation commerciale chez certains patients atteints d’emphysème pulmonaire sévère lié à l’AATD. L’augmentation de l’AAT aide uniquement à fournir de la SerpinA1 aux poumons où elle peut aider à prévenir les dommages causés par l’élastase neutrophile. Étant donné que la carence en sérum n’est pas la cause des lésions hépatiques, il n’existe pas de traitement spécifique pour les patients souffrant d’une maladie du foie associée à une ATA. Le seul traitement est des soins de soutien pour une insuffisance hépatique typique et une greffe de foie chez les patients atteints de cirrhose décompensée.

L’AATD est un trouble monogène qui en fait une cible idéale pour le traitement de l’ARNm. L’ARNm est une nouvelle modalité potentiellement applicable à un large éventail de maladies en raison de son énorme flexibilité par rapport aux thérapies biologiques et de remplacement enzymatique traditionnelles. Les thérapies basées sur l’ARNm utilisent la machinerie endogène de la cellule hôte pour la production et la modification post-traductionnelle des protéines cibles, ce qui permet le développement de thérapeutiques pour des maladies non ciblables auparavant. Nous avons effectué des études in vitro et in vivo pour déterminer si nous pouvions exprimer SerpinA1 codée de manière exogène et cibler l’ARNm/ la protéine vers l’organe approprié.

Le traitement par ARNm pourrait potentiellement cibler à la fois le foie et les poumons des patients déficients en AAT (en attente des expériences en cours). Nos données ont démontré une augmentation de la protéine SerpinA1 dans les milieux de culture cellulaire des fibroblastes patients traités par AAT, ainsi que dans les milieux de culture cellulaire des hépatocytes primaires dérivés des fibroblastes patients traités par AAT. De plus, chez les animaux WT recevant l’ARNm de SERPINA1 par injection intraveineuse, on a observé que l’ARNm de SERPINA1 et la protéine SerpinA1 étaient localisés à la fois dans le foie et les poumons. Pris ensemble, nos données suggèrent que l’expression médiée par l’ARNm de la protéine SerpinA1 dans les poumons pourrait inhiber l’élastase neutrophile, alors qu’elle pourrait favoriser l’expression de l’isoforme MM dans le foie et fournir de multiples voies bénéfiques pour les patients atteints de TAA.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Conditions de culture cellulaire des fibroblastes patients atteints d’AATD

. Les fibroblastes de patients suivants ont été obtenus du Coriell Institute for Medical Research, Cell Repository (Camden, New Jersey): GM11423 et GM12445 du foie du patient AATD et GM02522 de la peau du patient AATD et la lignée de fibroblastes de contrôle normale ND34769 de la peau. Les cellules ont été cultivées dans le Milieu Essentiel Minimum d’Eagle avec des sels d’Earle et des acides aminés non essentiels (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) additionné de sérum fœtal bovin à 15% et incubé à 37°C dans 5% de CO2.

Conditions de transfection. Les fibroblastes des patients ont été transfectés avec 2.5ug de chaque ARNm et 4 µl d’ARNm – Dans un réactif de transfection lipidique (MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD), dans 3 expériences indépendantes avec 3 répliques biologiques par expérience. Chaque ARNm a été dilué à 2,5 µg dans OptiMEM (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) et un volume d’ARNm-In similaire approprié a été dilué dans OptiMEM par puits et le protocole a été suivi conformément à la recommandation du fabricant. L’ARNm dilué a été mélangé avec du lipide dilué et laissé incuber pendant 15 minutes à température ambiante avant d’être ajouté aux cellules. Après addition d’un mélange ARNm-lipides aux fibroblastes des patients, les cellules ont été renvoyées à l’incubateur à 37°C avec 5% de CO2. Après 24 heures, les cellules ont été lavées doucement avec du PBS deux fois et lysées dans du tampon RIPA frais (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) avec des inhibiteurs de protéase 1X (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Lyse des cellules et quantification des protéines totales: Les lysats des cellules fibroblastes du patient ont été collectés dans des tubes de 0,5 mL (Eppendorf, Hambourg, Allemagne) et centrifugés à 18000 x g à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires. Après centrifugation, le surnageant clair a été soigneusement transféré dans un tube étiqueté séparé et placé sur de la glace. La concentration totale en protéines a été déterminée avec le kit d’analyse BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) en double exemplaire au format 96 puits selon le protocole du fabricant.

Électrophorèse capillaire automatisée Wes pour l’expression de SERPINA1. Les échantillons finaux de 5 µl chacun à une concentration protéique de 0,4 mg /mL ont été préparés en suivant les instructions du fabricant de Protein Simple Wes. Les lysats ont été analysés à l’aide du système d’électrophorèse capillaire basé sur la taille de la protéine Simple Wes (ProteinSimple Wes; ProteinSimple, San Jose, CA). Les protéines séparées par la taille ont été sondées avec des anticorps spécifiques de SERPINA1 à dilution 1: 125 (Novus NBP1-90309, Novus Biologics, Littleton, CO) et la Thiorédoxine de la femme de ménage à 1:1000 (CST 2429, Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), visualisée à l’aide d’anticorps secondaires de lapin marqués et quantifiée à l’aide du logiciel du fabricant. Pour chaque voie, l’aire sous la courbe (ASC) de la SERPINA1 a été normalisée à l’ASC du témoin thiorédoxine.

2.2. Hépatocytes Déficients en Alpha-1 Antitrypsine

Conditions de culture cellulaire. Des hépatocytes dérivés de patients atteints d’AATD ont été générés à partir de fibroblastes d’AATD par DefiniGen (Cambridge UK) en utilisant un protocole de différenciation exclusif. Les cellules ont été cultivées dans des milieux DTM et DRM (DefiniGen, Cambridge UK) et plaquées à 500 000 cellules par puits dans une plaque de 24 puits. Les cellules ont été cultivées dans des conditions hypoxiques à 37 ° C dans 5% de CO2 et 5% d’O2, le milieu étant changé tous les deux jours pendant 10 jours avant la transfection selon le protocole du fabricant propriétaire (DefiniGen, Cambridge UK). Les cellules ont été cultivées dans des conditions hypoxiques conformément aux instructions du fabricant, ce qui a permis la croissance cellulaire, tandis que les conditions non hypoxiques ont réduit la croissance cellulaire.

Conditions de transfection et Expression des protéines par ELISA. Les hépatocytes AATD ont été transfectés avec 4ul de Lipofectamine® 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) par 2.ARNm 5ug, dans 3 expériences indépendantes avec 3 répliques biologiques par expérience. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 24, 48 et 72 heures avant que le milieu de culture cellulaire ne soit retiré et que la concentration en protéine SerpinA1 soit dosée à l’aide d’un ELISA d’Abcam (Cambridge, MA) et suivant le protocole du fabricant.

2.3. Études in Vivo

Toutes les expériences, le logement des animaux, la manipulation et les procédures/protocoles expérimentaux ont été approuvés et réalisés conformément à Alexion Pharmaceuticals Inc. Directives et règlements de l’IACUC. Des souris mâles C57BL/6 (âgées de 6 semaines) ont été utilisées dans cette étude. Les souris ont été maintenues dans un environnement à température contrôlée avec un cycle lumière-obscurité de 12 h / 12 h, avec un régime alimentaire standard et de l’eau ad libitum.

Formulation d’ARNm en nanoparticules lipidiques et Dosage In Vivo. Des constructions d’ARNm ont été formulées à l’aide d’une nanoparticule lipidique ionisable auto-assemblante (PNL) contenant de l’ARNm SERPINA1. Un ARNm codant le GFP a été utilisé comme contrôle de véhicule chargé d’ARNm et le PBS a été utilisé comme contrôle négatif dans cette expérience. Les PNL ont été préparés par mélange rapide d’ARNm dans du tampon acétate à pH 4.0 avec un mélange lipidique, kit d’ARNm Hepato9 (Precision NanoSystems), en suspension dans de l’éthanol à un rapport lipides/ médicament de ~ 11 (poids / poids). Les animaux ont reçu une dose intraveineuse unique de 1,5 mg / kg d’ARNm formulé par la veine de la queue. Les animaux ont été sacrifiés 24 heures après l’injection et les tissus ont été fixés et traités pour l’hybridation in situ (ISH) et l’immunohistochimie (IHC).

Prélèvement d’échantillons et Préparation d’échantillons FFPE. Les animaux ont été nécropsiés et le lobe latéral gauche a été placé à plat dans des cassettes de tissus (Fisher Scientific). Les cassettes ont ensuite été placées dans un récipient rempli de Formol tamponné neutre à 10%, solution fixatrice NBF (Sigma) à un rapport minimum de 1: 20 du volume de tissu par rapport à la solution fixatrice. Les échantillons ont été autorisés à fixer pendant un minimum de 24h mais pas plus de 48h à température ambiante. Après la fixation du tissu, la cassette a été placée dans un récipient rempli de PBS pendant au plus 3 jours. Après le lavage du PBS, les tissus hépatiques ont été traités et incorporés dans des blocs de paraffine.

2.4. Immunohistochimie et Procédures d’hybridation In Situ

L’immunohistochimie de SERPINA1 a été réalisée sur des coupes tissulaires de 5 µm incrustées de paraffine fixées au formol en utilisant un anticorps contre SERPINA1 (Atlas, HPA001292 à 1:100). L’immunocoloration a été réalisée sur la plateforme Leica BOND RX (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) selon des protocoles standard avec des contrôles positifs appropriés. La récupération d’antigènes, standard sur la plate-forme Leica BOND RX, a utilisé la solution Leica ER1, EDTA-Tris, pH 8.0. Les lames ont été déshydratées dans une série d’éthanol gradué, nettoyées dans du xylène et montées à l’aide de Cytoseal. Les diapositives ont été imagées à l’aide du système VS120 à un grossissement de 40x (Olympus).

Pour la visualisation de l’ARNm, une hybridation in situ (ISH) a été effectuée. La sonde d’hybridation in situ d’ARN personnalisée (Affymetrix, Santa Clara, CA) a été conçue pour détecter l’ARNm SERPINA1. L’analyse ISH automatisée de l’ARN a été réalisée à l’aide du kit de détection ViewRNA eZ-L (Affymetrix, Santa Clara, CA) et de la plate-forme Leica BOND RX (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) a été utilisé. Des tissus fixés au formol et incorporés à la paraffine (FFPE) ont été préparés à une épaisseur de 5 um sur des lames de verre et placés sur la LIAISON Leica RX. Le test ViewRNA eZ-L a été effectué selon le protocole du fabricant mais, brièvement, l’ARN a été démasqué avec une incubation de 10 min à 95 ° C dans la Solution de Récupération d’Épitopes de Liaison 1 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL), suivie d’une incubation de 20 min avec la Protéinase K du Kit de prétraitement de l’enzyme de liaison à dilution 1: 1000 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Une hybridation a été réalisée avec une dilution de sonde SERPINA1 1:40 suivie d’une détection FastRed. Pour assurer l’intégrité de l’ARN et la procédure de dosage, des sections supplémentaires ont également été hybridées avec une sonde pour la peptidyl prolyl isomérase B (PPIB), une protéine d’entretien endogène utilisée comme témoin positif de l’ISH. Pour contrôler la coloration non spécifique, une sonde de contrôle contre la protéine bactérienne dihydrodipicolinate réductase (dapB) a été utilisée comme témoin négatif. Toutes les sondes étaient à une dilution de 1:40. Les lames ont été séchées à l’air, nettoyées dans du xylène et montées à l’aide de Cytoseal. Les diapositives ont été imagées à l’aide du système VS120 à un grossissement de 40x (Olympus).

3. Résultats

3.1. Expression de SerpinA1 Humaine Dérivée de l’ARNm dans des Lysats Cellulaires et des Milieux Cellulaires de Fibroblastes de Patients et d’Hépatocytes Primaires dérivés de Fibroblastes de Patients

L’ARNm de SERPINA1 humaine provenant de TriLink a été transfecté en fibroblastes de patients AATD, obtenus de l’Institut Coriell. Une augmentation significative de l’expression de la protéine SerpinA1 humaine a été observée dans les lysats cellulaires (Figure 1(a)) et les milieux de culture cellulaire (Figure 1(b)) lors de la transfection de SerpinA1 de type sauvage (WT) ou marqué par un drapeau (FT).

(a)
(a)
(b)
(b)

(a)
(a)(b)
(b)

Figure 1
In vitro human SerpinA1 expression in cell lysates (a) and cell media (b) from AATD patient fibroblasts and normal skin fibroblasts. Vehicle control is GFP mRNA; WT-SERPINA1 is WT mRNA sequence; FT-SerpinA1 is flag-tagged mRNA sequence.

Une transfection d’ARNm de SERPINA1 humain a également été réalisée dans des hépatocytes primaires dérivés de fibroblastes de patients obtenus à partir de DefiniGen. La sécrétion de la protéine WT SerpinA1 dans le milieu de culture a été augmentée à 24h par rapport au contrôle de l’ARNm du véhicule uniquement GFP. Nous avons observé une augmentation constante de l’expression de la protéine SerpinA1 au fil du temps, comme on l’a vu à 48h et 72h après la transfection (figure 2).

Figure 2
In vitro human SerpinA1 expression in cell culture media obtained from patient fibroblast-derived hepatocytes (DefiniGen, Cambridge UK).

3.2. In Vivo Human SerpinA1 Expression in WT Mice

Human SerpinA1 protein expression was subsequently evaluated in WT C57bl/6 mice. L’ARNm de SERPINA1 humain a été observé dans le foie (Figure 3(a)) comme on peut s’y attendre étant donné que l’ARNm est encapsulé dans une nanoparticule lipidique qui fournit généralement une grande quantité de sa cargaison au foie. Une découverte intrigante a été que l’ARNm de SERPINA1 a également été détecté dans les poumons de souris (figure 3(b)). L’expression de la protéine SerpinA1 a été détectée à l’aide d’un anticorps SerpinA1 spécifique à l’homme. La protéine SerpinA1 a été observée à la fois dans le foie (Figure 3(c)) et dans les poumons (Figure 3(d)). Le schéma de distribution sinusoïdal de l’expression de la protéine SerpinA1 dans le foie indique que la protéine SerpinA1 est probablement sécrétée dans le sang par les hépatocytes.

(b)

(c)(chaîne)

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(d)(d)

(a)
(a) (b)
(b)(redet)
(d)
(d)
distribution in vivo de l’arnm de serpina1 humain dans le foie (a) et les poumons (b) de wt mippa 24h après que i.v. a été détoxifié en face de l’ISH. Les points rouges de l’image représentent l’ARNm. La protéine SerpinA1 a été visualisée dans le foie (c) et les poumons (d) par IHC.

4. Discussion

La TCA est une maladie dévastatrice qui nécessite des traitements efficaces au bénéfice des patients. Le traitement d’augmentation actuel est inadéquat pour éviter des dommages à long terme au foie des patients atteints d’AATD. Actuellement, de nombreux groupes poursuivent de nouvelles modalités pour fournir des thérapies indispensables telles que la thérapie génique. Par exemple, la greffe de cellules souches dérivées de la moelle osseuse a été testée chez des souris AATD et a démontré un certain sauvetage de la détérioration des hépatocytes. Des stratégies de remplacement génique sont également testées en clinique, dans lesquelles un gène WT SERPINA1 est inséré dans le foie et exprime la protéine SerpinA1 appropriée. Les méthodes actuelles doivent encore être optimisées et la livraison de gènes médiée par l’AAV peut entraîner une diminution de la sécrétion de protéines médiée par les anticorps ou une réaction immunologique à la capside virale.

Nous avons évalué l’effet de l’expression transitoire de l’ARNm SERPINA1 dans le foie de souris, car la livraison de l’ARNm au foie est relativement simple et établie via des nanoparticules lipidiques (PNL), et nous pouvons administrer l’ARNm encapsulé dans la PNL sans réactions immunitaires significatives. Dans un premier temps, nous avons testé notre hypothèse sur des fibroblastes de patients atteints d’AATD et des hépatocytes primaires dérivés de fibroblastes de patients. Nos données démontrent clairement que nous pouvons coder SERPINA1 avec l’ARNm et exprimer ensuite la protéine SerpinA1 des deux types de cellules. Nous démontrons également que la protéine SerpinA1 est sécrétée par ces cellules et que les taux de protéines peuvent être mesurés dans le milieu de culture surnageant/cellulaire. Cela implique que la protéine SerpinA1 codée par l’ARNm est repliée et modifiée de manière appropriée dans la cellule pour permettre la sécrétion hors de l’ER et dans le milieu de culture cellulaire, ce qui est une caractéristique clé de cette thérapie par l’ARNm. En utilisant la thérapie par ARNm, nous pouvons utiliser les propres cellules du corps comme usine pour synthétiser les protéines, les modifier posttranslationnellement et finalement les sécréter dans la circulation sanguine. L’analyse préliminaire du milieu de culture cellulaire indique que la SerpinA1 sécrétée est active enzymatiquement dans un essai d’inhibition de l’élastase neutrophile (données non présentées). Nos données des figures 1, 2 et 3 suggèrent que les niveaux de protéine SerpinA1 sont significativement plus élevés que les niveaux de référence ou les niveaux témoins négatifs. Ces niveaux devraient être suffisants pour diminuer l’activité de l’élastase neutrophile dans le plasma et les poumons et ainsi prévenir la dégradation alvéolaire et l’emphysème, caractéristiques de l’AATD.

Nous avons étendu nos études pour déterminer si la SERPINA1 codée par l’ARNm pouvait être exprimée in vivo. Nos études démontrent que l’ARNm de SERPINA1 humain injecté par voie intraveineuse a atteint à la fois le foie et les poumons chez les souris WT (figures 3(a) et 3(b)). Ainsi, un traitement par ARNm encapsulé dans les lipides pourrait potentiellement cibler les deux sites de l’AATD (foie et poumon). Plus important encore, la protéine SerpinA1 humaine a été produite à la fois dans le foie et les poumons de souris WT (Figures 3(c) et 3(d)). Le schéma d’expression de la protéine SerpinA1 dans les sinusoïdes hépatiques indique que les protéines sont sécrétées par les hépatocytes ou un autre type de cellules hépatiques telles que les cellules étoilées qui expriment normalement SERPINA1. Nos données ne peuvent exclure la possibilité que l’ARNm pénètre ou soit exprimé par d’autres cellules hépatiques en plus des hépatocytes, et cela nécessitera des travaux supplémentaires. Il est possible que la protéine SerpinA1 humaine dans les poumons provienne de deux sources: l’ARNm SERPINA1 qui a atteint les poumons par injection intraveineuse, ainsi que le SerpinA1 humain sécrété produit par l’ARNm SERPINA1 humain dans le foie. Dans les deux cas, le potentiel d’expression et de localisation de la protéine SerpinA1 dans les poumons et le foie est prometteur car il pourrait bloquer les dommages médiés par l’élastase neutrophile dans les poumons tout en diminuant éventuellement les formes de PIZZ dans le foie. Cette dernière hypothèse est basée sur les études de Karadagi et al. dans lequel une augmentation de la protéine SerpinA1 par thérapie d’augmentation a démontré une diminution de la forme PIZZ chez le patient PBMC ATA. Cela soulève la possibilité que la protéine SerpinA1 codée par l’ARNm, lorsqu’elle est exprimée dans le foie, puisse diminuer la production hépatique de la forme PIZZ et inhiber par la suite la fibrose hépatique. L’inhibition de la fibrose hépatique et du stress aux URGENCES pourrait en fin de compte réduire / éliminer le besoin d’une greffe de foie du patient atteint d’un TCA. Notre hypothèse doit être testée in vivo dans un modèle AATD qui démontre une fibrose hépatique et une progression vers un carcinome hépatocellulaire.

Bien qu’il s’agisse de données intéressantes, nous tenons à souligner que les thérapies à base d’ARNm doivent être améliorées pour potentiellement apporter des avantages chroniques aux patients atteints de TCA. Les demi-vies actuelles de l’ARNm délivré de manière exogène sont généralement de 24 à 48h dans les tissus, tandis que les demi–vies des protéines varient en fonction de la protéine et de ses mécanismes de dégradation. Des stratégies pour augmenter la demi-vie des ARNM sont actuellement à l’étude et les premières données indiquent que nous pouvons augmenter la durée de stabilité de l’ARNm en modulant les UTR flanquant l’ARNm optimisé pour les codon. Des stratégies rationnelles d’ingénierie des protéines sont également ciblées pour faciliter l’augmentation de la demi-vie des protéines, ce qui entraîne une activité enzymatique accrue et, finalement, une diminution du besoin de dosage du traitement par ARNm. Ces nouvelles améliorations pourraient donner lieu à un traitement par ARNm qui est rarement dosé et maintient une activité enzymatique suffisante, par exemple de la protéine SerpinA1, pour apporter une amélioration clinique. Un autre aspect qui améliorerait les thérapies à base d’ARNm est la sécurité de l’administration de la PNL, grâce à laquelle nous pouvons doser les PNL toutes les quelques semaines. La technologie LNP actuelle facilite un régime de dosage une fois par mois, mais ne prend pas en charge un dosage plus fréquent si nous associons le dosage à l’efficacité. Comme mentionné précédemment, les thérapies d’ARNm encapsulées par LNP peuvent être redosées, contrairement à certaines thérapies géniques AAV, et la dose peut être titrée pour fournir un bénéfice maximal au patient.

5. Conclusion

Nos études présentent le potentiel d’une nouvelle modalité thérapeutique, la thérapie par ARNm, par laquelle une protéine manquante ou non fonctionnelle peut être remplacée pour effectuer des fonctions normales. Nos résultats démontrent que l’ARNm encapsulé dans les lipides peut être ciblé sur les poumons et le foie, qui sont les deux principaux sites de la maladie dans l’AATD. Alors que des études antérieures explorant le traitement de l’ARNm pour l’AATD ont montré l’expression de la protéine à 24h dans les cellules A549 et HEK293, nos études démontrent l’expression de la protéine SerpinA1 dans les fibroblastes de patients atteints d’AATD et les hépatocytes dérivés du patient qui sont des lignées cellulaires pertinentes pour la maladie. De plus, nous prolongeons des études antérieures dans ce domaine en démontrant que l’ARNm encapsulé dans les lipides peut se transmettre au foie et aux poumons de souris et produire la protéine SerpinA1 pour qu’elle soit fonctionnellement pertinente pour les patients. D’autres recherches doivent être menées dans un modèle de maladie AATD et pour assurer l’innocuité des dosages multiples d’ARNm chez les rongeurs et les animaux supérieurs avant d’envisager cette modalité pour une utilisation humaine. Pris ensemble, nos études soulèvent la possibilité intéressante que la thérapie par ARNm utilisant l’ARNm SERPINA1 puisse être bénéfique pour les patients atteints de TCA.

Disponibilité des données

Toutes les données à l’appui des résultats publiés dans cet article sont présentées dans l’article. Aucune autre donnée n’est disponible.

Conflits d’intérêts

Tous les auteurs sont des employés et des actionnaires d’Alexion Pharmaceuticals, Inc., une entreprise qui développe des thérapies pour les maladies rares et ultrarayes.

Contributions des auteurs

Brendan Connolly a conçu et réalisé la culture cellulaire, les transfections et le traitement d’échantillons in vivo. Cleo Isaacs a conçu et réalisé IHC. Lei Cheng a conçu et réalisé des expériences ISH, des manuscrits et des études in vivo. Kirtika H. Asrani a effectué des western blots, des immunoessais et un traitement d’échantillons in vivo. Romesh R. Subramanian a conçu des expériences, examiné des données et rédigé un manuscrit

Remerciements

Alexion Pharmaceuticals, Inc., est reconnu pour son financement.

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