Articles

források

Bevezetés

az Immunoassay egy biokémiai módszer, amely azonosítja és számszerűsíti az ismeretlen analitokat (fehérje, lipid, nukleinsav stb.) oldatban (szérum, vizelet stb.) antitest-antigén reakciók alkalmazásával. Az immunvizsgálatnak sokféle formája és változata létezik, de a legfontosabb szempont még mindig a specifikus antitest-antigén felismerés. Mi az antigén és az antitest? Miért kötődhet egy antitest egy antigénhez?

az antigén olyan molekula, amelyet az immunrendszer felismer, különösen az antitestek. A fehérjék, poliszacharidok, peszticidek, antibiotikumok, toxinok és hormonok mind antigének lehetnek. De nem minden antigén képes stimulálni az immunrendszert antitestek előállítására. Az immunválaszt kiváltó antigént, különösen az antitestszintézist immunogénnek nevezik. Az 5-10 kDa-nál nagyobb molekulatömegű fehérjék immunogének, míg a kis peptidek, peszticidek, antibiotikumok vagy hormonok nem. Ezeket az alacsony molekulatömegű anyagokat hapténeknek nevezik, és kémiailag össze kell kapcsolni nagyobb hordozómolekulákkal, például szarvasmarha szérum albuminnal vagy kulcslyukú limpet hemocianinnal, hogy specifikus antitestképződést váltsanak ki.

az antitest egy Y alakú nagy fehérje (160 kDa), amely két kombináló helyet (paratópot) tartalmaz, amelyek specifikusan az antigén korlátozott felületéhez (epitópjához) kötődnek. Az epitópok többnyire az antigén hidrofil részén helyezkednek el, méretük 10-15 aminosav-maradék, amelyek szomszédosak lehetnek a fehérjeláncon (lineáris epitóp) vagy szakaszosak, mégis térben közel vannak a fehérjelánchoz.

az antitest-antigén reakció egy tipikus reverzibilis bimolekuláris reakció, amelynek sebességállandói vannak az előre és hátra reakciókhoz, amelyek függenek az antigén (Ag) és az antitest (Ab) koncentrációjától, az antigénhez való affinitástól, amelyet az antitest asszociációs állandója határoz meg az antigénre, a hőmérsékletre, a pH-ra és más környezeti feltételekre. Az immunvizsgálatok az antigén antitesthez való kötődésén és komplexumán alapulnak, és az emberek valamilyen fizikai vagy kémiai eszközt használnak az antigén-antitest komplex mérésére és számszerűsítésére.

antigén és antitest

1.ábra. Antigén és antitest. (a) a kis molekulák felismerhetők antitestekkel, de nem stimulálhatják az immunrendszert antitest előállítására. Kombinálniuk kell adjuvánsokkal (általában fehérjékkel), hogy immunogént képezzenek. A fehérjék mindig immunogének lehetnek. (b) az antitest képes felismerni az antigén szerkezeti specifikus területeit, amelyet epitópnak neveznek. Az antitest felismerési területeit paratopoknak nevezzük. (c)az antitest egy Y alakú molekuláris. d) az antitest két nehéz és két könnyű láncból áll, amelyeket diszulfidkötések kötnek össze. A H és L láncok Fab fragmensei nagyon változatosak, az Fc fragmensek pedig konzervatívak.

Immunprecipitáció

számos módszert fejlesztettek ki az elsődleges Ag-Ab reakció megjelenítésére. A nagy térhálósított Ag-Ab komplexek kicsapódása szabad szemmel látható, anélkül, hogy az amplifikációhoz címkézett reagenseket használnának.

a kicsapódási reakció egy nagyon specifikus szerológiai reakció, amely magában foglalja az antigén antitesttel történő kötődését. Minden antitestnek két antigénkötő helye van, és minden antigénnek több antigén epitópja van. Amikor az oldható antigéneket antitest köti össze, hogy térhálósított “rácsos” szerkezetet képezzenek, a reakciót kicsapódásnak nevezzük. A kicsapódási reakció gátolt, ha akár antigén, akár antitest nagy feleslegben van jelen. Az optimális koncentráció tartományát, amelyen a legnagyobb mennyiségű csapadék keletkezik, ekvivalens zónának nevezzük. Ezen elv alapján a specifikus antigének jelenléte a keverékben és az antigének relatív koncentrációja antitestek alkalmazásával kimutatható.

Immundiffúziós mechanizmus

2.ábra. Immundiffúziós mechanizmus. a) a csapadék mennyiségét befolyásolja az antitest és az antigén koncentrációja. (b) sematikus radiális immundiffúzió. c) A kettős immundiffúzió vázlata.

kétféle kicsapási reakció használható az antitestek vagy antigének relatív koncentrációjának meghatározására. Ezek a radiális immundiffúzió (a Mancini módszer) és a kettős immundiffúzió (az Ouchterlony módszer). Mindkettőt félszilárd közegben, például agar-ban hajtják végre. Radiális immundiffúzió esetén az antigénmintát egy kútba helyezzük, és hagyjuk diffundálni egy antiszérum megfelelő hígítását tartalmazó agarba. Amint az antigén az agarba diffundál, létrejön az ekvivalencia régió, és a kút körül egy kicsapódási gyűrű, valamint egy precipitin gyűrű alakul ki (2b ábra). A precipitin gyűrű területe arányos az antigén koncentrációjával. Ha összehasonlítjuk a precipitingyűrű területét egy standard görbével (amelyet az antigén ismert koncentrációinak precipitin területeinek mérésével kapunk), meghatározhatjuk az antigénminta koncentrációját. Az Ouchterlony módszerben mind az antigén, mind az antitest sugárirányban diffundál a kutakból egymás felé, ezáltal koncentrációs gradienst hozva létre. Az egyenértékűség elérésekor látható csapadékvonal alakul ki (2C ábra).

bár hasznos, az immundiffúzió és az immunelektroforézis unalmas és időigényes, nehezen automatizálható, és nem könnyen alkalmazható a tömegminta elemzésére.

jelölt Immunoassay

az Immunoassays számos különböző címkét alkalmaz az antitestek és antigének kimutatásához. A címkék általában kémiai kapcsolatban állnak vagy konjugálódnak a kívánt antitesttel vagy antigénnel.

a címke és a jel detektálási stratégia különbsége szerint az immunvizsgálat a következő típusokba sorolható:

1. Radioimmunoassay (ria)

A RIA olyan immunvizsgálat, amely radioaktív izotópokat (pl. I-235) használ az antitest/antigén címkézésére. Detektálja a radioaktivitást az antitest-antigén vegyület mérésére nagyon nagy érzékenységgel. A Ria volt a legkorábbi kifejlesztett immunvizsgálatok egyike,és nagyrészt a radioaktivitással végzett munka nehézségei és potenciális veszélyei miatt esett ki.

2. Enzim Immunoassay (EIA)

EIA valószínűleg az egyik legnépszerűbb használt immunoassays. A radioaktív izotópok helyett az EIA enzimeket (például HRP, AP) használ szondaként. Ezek az enzimek gyakran lehetővé teszik a kimutatást, mivel megfigyelhető színváltozást eredményeznek bizonyos szubsztrát és kromogén reagensek (pl. DAB, TMB) jelenlétében az enzimatikus reakciók alapján.

Tudjon meg többet az ELISA készlet fejlesztéséről

3. A Fluoroimmunoassay (FIA)

FIA analóg a RIA-val, azzal a különbséggel, hogy a címke fluorofor (pl. FITC, phycoerythrin), nem pedig radioizotóp. A fluoreszcencia jel közvetlenül mérhető a műszer detektálásával.

4. Kemilumineszcencia immunvizsgálat (CLIA)

a CLIA egy módszer a minták koncentrációjának meghatározására a kémiai reakció által kibocsátott lumineszcencia intenzitása szerint. A CLIA egyesíti a CL rendszereket és az immunreakciókat. Egyes reagenseket CL címkékként használtak. A CL szubsztrátok bevezetése után a rendszer kemilumineszcenciát termel. Tehát a minták kvantitatív módon kimutathatók. A legnépszerűbb CL szubsztrátok a luminol, az izoluminol és származékaik, az akridinium-észter származék, a peroxidáz és az alkalikus foszfatáz (ALP).

5. Immunkromatograohikus vizsgálat (ICA)

az ICA, más néven laterális áramlási immunoassay egy gyorsteszt immunoassay a célelemzés jelenlétének (vagy hiányának) kimutatására a mintában (mátrixban) speciális és költséges berendezések nélkül. Ebben a fajta vizsgálatban a befogási antitesteket keresztvonalként rögzítik egy porózus hidrofil anyagon. A pufferben lévő analitokat ezután a tesztcsík egyik oldalára adjuk, amelyet az oldalsó kapilláris erő hajt. Az analitok átfolynak a capture antitest vonalon, és az antitest elfogja őket. Ahogy a befogott analitok felhalmozódtak, a komplexet a nanorészecskék (általában kolloid arany) címkéivel lehetett feltárni, és szabad szemmel közvetlenül megtekinteni.

a fenti öt különböző jelölt immunvizsgálat összehasonlítását a következő táblázat tartalmazza. Mindegyik módszernek megvannak a maga előnyei és hátrányai, így rugalmasan választhattuk ki a legmegfelelőbb eszközt a teszt optimalizálásához.

Illustration Label Substrates Signal Sensitivity Advantages Drawbacks
Radioimmunoassay
(RIA)
Radioimmunoassay Radioactive
Isotopes
(I-125)
None Radiation Ultrahigh 1. Sensitive and precise
2. Radio-label conjugation easy to prepare
1. A radioizotópokat néhány héten belül fel kell használni
2. Sugárterhelés kockázata
enzim Immunoassay
(EIA)
enzim Immunoassay enzimek
(HRP,AP)
kromogén/ szubsztrát színváltozás magas 1. Érzékeny és biztonságos
2. Gyors és kényelmes, könnyen automatizálható
3. Széles körben használják a különböző teszt
1. Monoklonális antitestre van szükség
2. Nem specifikus felszívódás
3. Az enzim / szubsztrát reakció rövid távú, ezért hamarosan el kell olvasni.
Fluoroimmunoassay
(FIA)
Fluorenscence Immunoassay Fluorogenic
Reporters
(Rhodamine)
None Fluorescence High 1. Sensitive, specific and save
2. Limited background fluorescence
3. Easy to automation
4. multiple label can be used
1. Rely on fluorescence detecting instrument
2. Photo bleaching
Chemiluminescence
Immunoassay
(CLIA)
Chemiluminescence Immunoassay Chemical
probes
(Acridinium Ester, luminol)
luminescence substrate Visible light Ultrahigh 1. Excellent sensitivity and safe
2. Stable of reagent
3. Könnyen automatizálható, nagy teljesítményű rendszerben használható
CCD berendezésre van szükség a fényjel rögzítéséhez
kolloid arany
immunkromatográfiás
Assay
(ICA)
kolloid arany Immunkromatorgrafikus vizsgálat kolloid arany
Nanorészecske
nincs látható szín alacsony 1. Gyors, könnyen használható
2. Olcsó és biztonságos
3. Látható, felszerelés nélkül
alacsony érzékenység és specificitás

6. Immunhisztokémia (IHC)

az IHC szövettani, immunológiai és biokémiai technikákat kombinál a specifikus szövetkomponensek azonosítására egy látható címkével ellátott specifikus antigén / antitest reakció segítségével. Az IHC lehetővé teszi az egyes sejtkomponensek eloszlásának és lokalizációjának vizualizálását egy sejten vagy szöveten belül. Az IHC legnépszerűbb típusa egy enzim vagy egy fluorofor által közvetített kromogén és fluoreszcencia detektálás, amelynek alapelve megegyezik az EIA-val és az FIA-val.

Címke nélküli immunvizsgálat

míg az immunvizsgálatokban általában valamilyen címkét alkalmaznak, vannak bizonyos típusú vizsgálatok, amelyek nem támaszkodnak címkékre. Ehelyett olyan észlelési módszereket alkalmazzon, amelyek nem igénylik a vizsgálat összetevőinek módosítását vagy címkézését. A Surface plasma resonance (SPR) és a quartz crystal microbalance (QCM) két tipikus címke nélküli módszer.

a felületi plazma rezonancia a vezető elektronok rezonáns oszcillációja a beeső fény által stimulált negatív és pozitív permittivitási anyag közötti interfészen. Lényegében az érzékelő chip szubsztrátfóliájához kötött analit tömege változtatja meg a különböző módon mérhető törésmutatót. Nincs szükség címkézett reporter molekulára. Mivel az SPR változásai gyorsan bekövetkeznek és valós időben monitorozhatók, a kötési reakció kinetikája tanulmányozható.

kvarckristály mikromérleg a fordított piezoelektromos hatás alapján. Az elektróda felületén a tömeglerakódás arányos a szubsztrátkristály rezonancia frekvenciájával. Ha immobilizáljuk a capture antitestet a QCM chip elektróda felületén, és áramoljuk az analitot, akkor az antitest és az analit kötési folyamata mérhető a frekvenciaváltozás kimutatásával antitest vagy antigén címke nélkül.

Darwish I A. immunvizsgálati módszerek és alkalmazásuk a gyógyszerészeti elemzésben: alapvető módszertan és a legújabb fejlemények. Int J Biomed Sci, 2006, 2: 217-235.
Levieux D. 11 Immundiagnosztikai technológia és alkalmazásai. Az Élelmiszerdiagnosztika fejlődése, 2008: 211.
Brandon D L, Carter J M. Immunoassay. Élelmiszerbiztonsági mérnöki kézikönyv, 2012: 279-312.
Ricchiuti V. IMMUNOASSAY-alapú TECHNOL-OGIES F vagy a biomarkerek felfedezéséhez és transzlációs kutatásához használt biológiai anyagok mérése. Biomarkerek: az orvostudományban, a kábítószer-felfedezésben és a környezeti egészségben, 2010: 425.
Proll G, Ehni M. Immunvizsgálatok. Spektroszkópia kézikönyve: második, kibővített kiadás, 2014: 1313-1334.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.