Articles

SERPINA1 mRNS az alfa-1 antitripszin hiány kezelésére

absztrakt

az alfa-1-antitripszin (AAT) hiány egy genetikai rendellenesség, amely inaktív/hibás AAT-t termel az AAT-t kódoló SERPINA1 gén mutációi miatt. Ez a betegség az AAT csökkent aktivitásával jár a tüdőben és a túlzott hibás AAT fehérje lerakódásával a májban. Jelenleg nincs specifikus kezelés az AAT-hiányhoz kapcsolódó májbetegségekre. Az AAT tüdőbetegséget gyakran a szérumfehérje-helyettesítő termékek egyikével kezelik; a SerpinA1 helyettesítő terápia hatékonyságára vonatkozó hosszú távú vizsgálatok azonban nem állnak rendelkezésre, és nem csökkenti a májkárosodást az AAT-hiányban. az mRNS terápia potenciálisan megcélozhatja mind az AAT-hiányos betegek máját, mind tüdejét. Az AAT-beteg fibroblasztjait és az AAT-beteg fibroblasztból származó hepatocitáit serpina1-kódoló mRNS-sel transzfektálták, és sejttenyészeteken SerpinA1 expressziót vizsgáltak. Adataink azt mutatják, hogy a SerpinA1 fehérje megnövekedett a kezelt AAT-beteg fibroblasztokból és az AAT-beteg fibroblasztból származó hepatocitákból származó táptalajokban. Vad típusú egereken végzett in vivo vizsgálatok kimutatták a serpina1 mRNS biológiai eloszlását a májban és a tüdőben, valamint a SerpinA1 fehérje expresszióját ebben a két célszervben, amelyek kritikusan érintettek az AAT-hiányban. Adataink együttesen azt sugallják, hogy a SerpinA1 mRNS terápia előnyös lehet az AAT-hiányban szenvedő betegek számára.

1. Bevezetés

az alfa-1-antitripszin hiány (Aatd) pusztító betegség, megfelelő terápiák hiányában. A jelenlegi terápiák csak a tüdőt védik, és előrehaladott esetekben gyakori intravénás injekciókat igényelnek a plazma eredetű AAT fehérjéből. Az AATD-ben szenvedő betegek hajlamosak obstruktív tüdőbetegségre és májbetegségre (pl. cirrhosis és hepatocelluláris carcinoma gyermekeknél és felnőtteknél) . A diagnosztizált krónikus obstruktív tüdőbetegségben (COPD) szenvedő betegek körülbelül 1-5%-ánál becslések szerint alfa-1-antitripszin hiány van . Bár rendkívül ritka, aatd-ben szenvedő gyermekeknél emfizémát jelentettek, és a májbetegség előfordulása az életkorral növekszik . Súlyos tünetek jelentkeznek az élet későbbi szakaszában, különösen a dohányosoknál. Az AATD máj tünetei későn jelentkeznek, és gyakran májátültetést igényelnek. Az aatd egy örökletes betegség, amelyet a SERPINA1 génen belüli mutációk okoznak . A SERPINA1 génnek két allélja van, amelyeket M alléloknak neveznek (a normál betegek MM genotípusúak). A leggyakoribb allélt, amely súlyos AAT-hiányt eredményez, Z-nek (E342K) nevezzük . Beszámoltak arról, hogy a súlyos AATD-s betegek 95% – ánál van zz genotípus, és a SerpinA1 szérumszintnek csak 10-20% – a van . ZZ mutáció esetén a SerpinA1 fehérje nem képes megfelelően összehajtani, és a májsejtek nem választják ki; ezért az AATD-t nem a fehérje előállítására való képtelenség, hanem a funkcionális fehérje kiválasztására való képtelenség okozza. A ZZ SerpinA1 felhalmozódása hepatocitákban súlyos májkárosodást eredményez . A homozigóta PIZZ meglehetősen gyakori és 1: 2500-3000 születéskor fordul elő Észak-Amerikában és Európában.

az alfa-1-antitripszin (AAT), más néven SERPINA1 (szerin proteáz inhibitor, a csoport, 1 .TAG) egy szekretált fehérje, amelyet elsősorban hepatociták, kisebb mértékben mononukleáris fagociták, neutrofilek és légúti / bélhámsejtek termelnek. A SerpinA1 egy keringő glikoprotein, amely szintén vízben oldódó és szöveti diffúz . A SerpinA1 elsődleges szerepe a szerin proteáz szabályozása, amelynek fő helye a tüdőben van. Ott a SerpinA1 megköti és inaktiválja a neutrofil elasztázt, ezáltal védi az alveoláris szöveteket a proteolitikus lebomlástól a gyulladásos reakciók során . A SerpinA1 a leggyakoribb keringő anti-proteáz, és a SerpinA1 normál plazmakoncentrációja általában eléri az 1-2g/L-t .

az AATD-t a rosszul összehajtott SerpinA1 fehérjék polimerizációja jellemzi a májsejtek durva endoplazmatikus retikulumában, ami csökkenti a SerpinA1 koncentrációját és aktivitását a vérben és a szövetekben . Súlyos hiányban szenvedő betegeknél a SerpinA1 szérumszintje 50 mg/dL alatt van, míg a normál szint 200 mg/dL. A keringő Szerpina1 alacsony szintje esetén a tüdő nem védett a neutrofil elasztáztól, egy enzimtől, amely elpusztítja az alveolusokat és tüdőbetegséget okoz. Ezért az AATD leggyakoribb klinikai szövődményei a pulmonalis emphysema és a májbetegség .

a mai napig csak AAT augmentációs terápia áll rendelkezésre az AATD kezelésére. Az AAT augmentációs terápiát 1987-ben fejlesztették ki, és jelenleg csak a súlyos aatd-vel összefüggő pulmonalis emfizémában szenvedő kiválasztott betegek kereskedelmi használatára engedélyezett . Az AAT augmentáció csak a SerpinA1-et juttatja a tüdőbe, ahol segíthet megelőzni a neutrofil elasztáz károsodását. Mivel a szérumhiány nem okozza a májkárosodást, az AATD-vel összefüggő májbetegségben szenvedő betegek számára nincs specifikus kezelés. Az egyetlen kezelés a tipikus májelégtelenség és a dekompenzált cirrhosisban szenvedő betegek májátültetése .

az AATD egy monogén rendellenesség, amely ideális célponttá teszi mRNS terápia. az mRNS egy újszerű módszer, amely a betegségek széles körére alkalmazható, mivel óriási rugalmassággal rendelkezik a hagyományos biológiai és enzimpótló terápiákkal szemben. az mRNS-alapú terápiák a gazdasejt endogén gépezetét használják a célfehérjék előállítására és poszttranszlációs módosítására, lehetővé téve a korábban nem célzott betegségek terápiáinak fejlesztését. In vitro és in vivo vizsgálatokat végeztünk annak megállapítására, hogy képesek vagyunk-e exogén módon kódolt SerpinA1-et expresszálni, és az mRNS-t/fehérjét a megfelelő szervre irányítani.

az mRNS terápia potenciálisan megcélozhatja mind az AAT-hiányos betegek máját, mind tüdejét (a jelenlegi kísérletek függvényében). Adataink megnövekedett SerpinA1 fehérjét mutattak a kezelt AAT beteg fibroblasztok sejttenyészetében, valamint az AAT beteg fibroblasztból származó primer hepatociták sejttenyészetében. Ezenkívül a SERPINA1 mRNS-t intravénás injekció formájában kapó WT állatokban mind a SERPINA1 mRNS, mind a SerpinA1 fehérje lokalizációját figyelték meg mind a májban, mind a tüdőben. Adataink együttesen azt sugallják, hogy a serpina1 fehérje mRNS által közvetített expressziója a tüdőben gátolhatja a neutrofil elasztázt, míg elősegítheti az MM izoform expresszióját a májban, és több előnyös utat biztosíthat az AAT betegek számára.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Aatd beteg fibroblasztok

sejttenyészet feltételek. A következő beteg fibroblasztokat nyertük a Coriell orvosi Kutatóintézetből, Sejttárból (Camden, NJ): GM11423 és GM12445 az AATD beteg májából és GM02522 az AATD beteg bőréből és a normál kontroll fibroblaszt vonal ND34769 a bőrből. A sejteket Eagle minimális esszenciális közegében, Earle sóival és nem esszenciális aminosavaival (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) 15% – os magzati szarvasmarha-szérummal kiegészítve, 37 CC-n inkubálva 5% CO2-ban.

Transzfekciós feltételek. A beteg fibroblasztjait 2-vel transzfektáltuk.Minden mRNS-ből 5 ug-t és 4 ppl mRNS-t lipidtranszfekciós reagensben (MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD), 3 független kísérletben, kísérletenként 3 biológiai ismétléssel. Minden mRNS-t 2,5 ezerg-ra hígítottunk az OptiMEM-ben (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) és hasonlóan megfelelő mennyiségű mRNS-in-t OptiMEM per well-ben hígítottunk, és a gyártó ajánlása szerint a protokollt követtük. A hígított mRNS-t összekeverjük a hígított lipiddel, és hagyjuk szobahőmérsékleten 15 percig inkubálni, mielőtt hozzáadnánk a sejtekhez. Miután mRNS-lipid keveréket adtak a beteg fibroblasztjaihoz, a sejteket 37-nél tettük vissza inkubátor C 5% CO2-val. 24 óra elteltével a sejteket kétszer óvatosan PBS-sel mostuk, majd friss RIPA pufferben (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) lizáltuk 1X proteáz inhibitorokkal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

sejtlízis és a teljes fehérje mennyiségi meghatározása: a beteg fibroblaszt sejt lizátumait 0,5 mL-es csövekben gyűjtöttük össze (Eppendorf, Hamburg, Németország), és 18000 x g-os centrifugálással 4 cc-nál a sejttörmelék eltávolítása érdekében. Centrifugálás után a tiszta felülúszót óvatosan egy külön címkével ellátott csőbe helyeztük, és jégre helyeztük. A teljes fehérjekoncentrációt a BCA assay kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) két példányban, 96 kút formátumban, a gyártó protokollja szerint.

Wes automatizált kapilláris elektroforézis SERPINA1 Expresszióhoz. A végső mintákat egyenként 5 db 0,4 mg / mL fehérjekoncentráció mellett állítottuk elő a Protein Simple Wes gyártó utasításai szerint. A lizátumokat a Protein Simple Wes méretalapú kapilláris elektroforézis rendszer (ProteinSimple Wes; ProteinSimple, San Jose, CA). A mérettől elválasztott fehérjéket SERPINA1-re specifikus antitestekkel vizsgálták 1:125 hígításnál (Novus NBP1-90309, Novus Biologics, Littleton, CO) és a házvezetőnő Tioredoxinnal 1: 1000-nél (CST 2429, Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), címkézett nyúl másodlagos antitestekkel vizualizálva, és a gyártó szoftverével számszerűsítve. Minden sáv esetében a SERPINA1 görbe alatti területét (AUC) a Tioredoxin-kontroll AUC-jára normalizáltuk.

2.2. Alfa-1 antitripszin hiányos hepatocyták

sejttenyészet feltételek. Az Aatd betegből származó hepatocitákat Aatd fibroblasztokból generálta a DefiniGen (Cambridge UK) szabadalmaztatott differenciálási protokoll alkalmazásával. A sejteket DTM media-ben és DRM media-ban (DefiniGen, Cambridge UK) termesztették, és 500 000 cellát vontak be egy 24 lyukú lemezre. A sejteket hipoxiás körülmények között termesztettük 37cl C – ben 5% CO2-ban és 5% O2-ben, a táptalajt kétnaponta cserélték a transzfekció előtt 10 napig a szabadalmaztatott gyártó protokollja alapján (DefiniGen, Cambridge UK). A sejteket hipoxiás körülmények között termesztettük a gyártó utasításai szerint, ami lehetővé tette a sejtek növekedését, míg a nem hipoxiás körülmények csökkentették a sejtek növekedését.

Transzfekciós állapotok és fehérje expresszió ELISA-val. Az AATD hepatocitákat 4UL Lipofektaminnal Transzfektáltuk 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) per 2.5ug mRNS, 3 független kísérletben, kísérletenként 3 biológiai ismétléssel. A sejteket ezután 24, 48 és 72 órán át inkubáltuk, mielőtt a sejttenyésztő táptalajt eltávolítottuk és a SerpinA1 fehérje koncentrációját az Abcam (Cambridge, MA) ELISA-jával és a gyártó protokolljának megfelelően vizsgáltuk.

2.3. In Vivo vizsgálatok

minden kísérletet, állattartást, kezelést és kísérleti eljárást/protokollt az Alexion Pharmaceuticals Inc.előírásainak megfelelően hagytak jóvá és hajtottak végre. Iacuc irányelvek és rendeletek. C57BL/6 hím egeret (6 hetes) használtak ebben a vizsgálatban. Az egereket 12-h/12-h Világos-Sötét ciklusú, szabályozott hőmérsékletű környezetben tartották, szokásos étrenddel és vízzel Ad libitum.

az mRNS Lipid Nanorészecskékké történő Formulálása és In Vivo adagolás. az mRNS-konstrukciókat egy SZERPINA1 mRNS-t tartalmazó önszerelő ionizálható lipid Nanorészecske (LNP) felhasználásával állítottuk elő. MRNS-t kódoló GFP-t használtunk mRNS-vel terhelt járművezérlőként, a PBS-t pedig negatív kontrollként használtuk ebben a kísérletben. Az LNP-ket úgy állítottuk elő, hogy az mRNS-t acetátpufferben 4 pH-n gyorsan összekeverjük.0 lipidkeverékkel, Hepato9 mRNS kit (Precision NanoSystems), etanolban szuszpendálva ~11 (wt/wt) lipid-gyógyszer arányban. Az állatokat egyetlen, 1,5 mg/kg formulált mRNS intravénás adaggal injektálták a farokvénán keresztül. Az állatokat az injekció beadása után 24 órával feláldozták, és a szöveteket rögzítették és feldolgozták in situ hibridizáció (ISH) és immunhisztokémia (IHC) céljából.

mintagyűjtés és FFPE mintaelőkészítés. Az állatokat boncolták, a bal oldali lebenyt pedig laposan helyezték el szövetkazettákba (Fisher Scientific). A kazettákat ezután 10% semleges pufferolt formalin, NBF (Sigma) fixáló oldattal töltött tartályba helyeztük, a szövet térfogatának legalább 1:20 arányával a fixáló oldattal szemben. A mintákat szobahőmérsékleten legalább 24 órán át, de legfeljebb 48 órán át hagytuk rögzíteni. A szövet rögzítése után a kazettát legfeljebb 3 napig PBS-sel töltött tartályba helyeztük. A PBS mosás után a májszöveteket feldolgoztuk és paraffinblokkokba ágyaztuk.

2.4. Immunhisztokémiai és In Situ hibridizációs eljárások

A SERPINA1 Immunhisztokémiáját formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott, 5 db-os szövetszakaszokon végeztük SERPINA1 elleni antitest alkalmazásával (Atlas, HPA001292 1:100-kor). Az immunfestést a Leica BOND RX platformon (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) szabványos protokollok szerint, megfelelő pozitív kontrollokkal. A Leica BOND RX platformon standard antigén-visszakeresés a Leica ER1, EDTA-Tris, pH 8.0 oldatot használta. A diákat Osztályozott etanol-sorozatban dehidratáltuk, xilolban tisztítottuk, és Cytoseal segítségével szereltük fel. A diákat a VS120 rendszer 40-szeres nagyítással (Olympus).

az mRNS megjelenítéshez in situ hibridizációt (ISH) végeztünk. Az egyedi RNS in situ hibridizációs szondát (Affymetrix, Santa Clara, CA) a SERPINA1 mRNS kimutatására tervezték. Az automatizált RNS ISH vizsgálatot a ViewRNA eZ-L detektáló készlet (Affymetrix, Santa Clara, CA) és a Leica BOND RX platform (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) használták. A formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott (FFPE) szöveteket üveglemezeken 5 um vastagságban állítottuk elő, majd a Leica BOND RX-re helyeztük. A ViewRNA eZ-L vizsgálatot a manufactures protokoll szerint futtattuk, de röviden, az RNS-t 10 perces inkubációval lepleztük le 95 C-on a Bond Epitope visszakeresési oldatban 1 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL), majd 20 perces inkubációval proteináz K-val a Bond enzim előkezelő készletéből 1:1000 hígítással (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). A hibridizációt SERPINA1 1:40 szondahígítással végeztük, amelyet FastRed detektálás követett. Az RNS integritásának és a vizsgálati eljárásnak a biztosítása érdekében további szakaszokat hibridizáltak a peptidil-prolil-izomeráz B (PPIB), az ISH pozitív kontrolljaként használt endogén háztartási fehérje szondájával. A nem specifikus festés szabályozására negatív kontrollként a bakteriális fehérje-dihidrodipikolinát-reduktáz (dapB) elleni kontrollszondát használtuk. Minden szonda 1: 40-es hígításban volt. A diákat levegőn szárítottuk, xilolban tisztítottuk, és Cytoseal segítségével szereltük fel. A diákat a VS120 rendszer 40-szeres nagyítással (Olympus).

3. Eredmények

3.1. mRNS-eredetű humán SerpinA1 expresszió a beteg fibroblasztok és a beteg Fibroblasztból származó primer hepatociták Sejtlizátumaiban és Sejtközegeiben

A Trilinkből származó humán SERPINA1 mRNS-t aatd beteg fibroblasztokká transzfektálták, a Coriell intézetből nyerték. A humán SerpinA1 fehérje expressziójának jelentős növekedését figyelték meg sejtlizátumokban(1.A) Ábra) és sejttenyészetekben (1. b) ábra) vad típusú(WT) vagy FLAG-tagged (FT) SerpinA1 transzfekciója esetén.

(a)
(a)
(b)
(b)

(a)
(a)(b)
(b)

Figure 1
In vitro human SerpinA1 expression in cell lysates (a) and cell media (b) from AATD patient fibroblasts and normal skin fibroblasts. Vehicle control is GFP mRNA; WT-SERPINA1 is WT mRNA sequence; FT-SerpinA1 is flag-tagged mRNA sequence.

humán SERPINA1 mRNS transzfekciót is végeztek a beteg Fibroblasztból származó primer hepatocitáiban, amelyeket a DefiniGen-ből nyertek. A WT SerpinA1 fehérje szekréciója a tápközegbe 24 óra alatt nőtt a vivőanyaghoz képest csak GFP mRNS kontroll. Megfigyeltük a SerpinA1 fehérje expressziójának következetes növekedését az idő múlásával, amint azt a transzfekció után 48 óra és 72 óra alatt észleltük (2.ábra).

Figure 2
In vitro human SerpinA1 expression in cell culture media obtained from patient fibroblast-derived hepatocytes (DefiniGen, Cambridge UK).

3.2. In Vivo Human SerpinA1 Expression in WT Mice

Human SerpinA1 protein expression was subsequently evaluated in WT C57bl/6 mice. Humán SERPINA1 mRNS-t figyeltek meg a májban (3(A) ábra), amint az várható, mivel az mRNS egy lipid nanorészecskébe van kapszulázva, amely általában nagy mennyiségű rakományt szállít a májba. Érdekes megállapítás volt, hogy a SERPINA1 mRNS-t egerek tüdejében is kimutatták (3(b) ábra). A SerpinA1 fehérje expresszióját humán specifikus SerpinA1 antitest alkalmazásával detektáltuk. A SerpinA1 fehérjét mind a májban (3.c) ábra), mind a tüdőben(3. D) ábra) észlelték. A serpina1 fehérje expressziójának szinuszos eloszlási mintázata a májban azt jelzi, hogy a SerpinA1 fehérjét valószínűleg a hepatociták választják ki a vérbe.

(b)(b)

(c)(string)

div>

(d)(d)

(a)

(a) (B)
(b) (redet)
(d)
(D)

in vivo humán szerpina1 mRNS kétszeri eloszlása a WT mippa 24h májában (a) és tüdejében(B), miután az i.v. – t az ish-val szemben méregtelenítették. A képen piros pontok képviselik az mRNS-t. A SerpinA1 fehérjét az IHC vizualizálta a májban (c) és a tüdőben (d).

4. Vita

az AATD pusztító betegség, amelynek hatékony terápiákra van szüksége a betegek javára. A jelenlegi augmentációs terápia nem megfelelő az aatd betegek májának hosszú távú károsodásának elkerülése érdekében. Jelenleg sok csoport új módszereket folytat a nagyon szükséges terápiák, például a génterápia biztosítása érdekében. Például a csontvelőből származó őssejt-transzplantációt AATD egereken tesztelték, és kimutatták a hepatocita-romlás bizonyos mértékű megmentését . Génpótló stratégiákat is tesztelnek a klinikán, ahol egy WT SERPINA1 gént helyeznek be a májba, és kifejezi a megfelelő SerpinA1 fehérjét. A jelenlegi módszereket még optimalizálni kell, és az AAV által közvetített génszállítás antitest által közvetített fehérje szekréció csökkenését vagy immunológiai reakciót okozhat a vírus kapszidjával szemben.

értékeltük a serpina1 mRNS átmeneti expressziójának hatását egérmájban, mivel az mRNS májba történő szállítása viszonylag egyszerű és lipid nanorészecskék (LNP) révén állapítható meg, és jelentős immunreakciók nélkül beadhatjuk az LNP-kapszulázott mRNS-t. Kezdetben teszteltük hipotézisünket aatd beteg fibroblasztokban és beteg fibroblasztból származó primer hepatocitákban. Adataink egyértelműen bizonyítják, hogy a SERPINA1-et mRNS-sel kódolhatjuk, majd mindkét sejttípusból SerpinA1 fehérjét expresszálhatunk. Azt is kimutatjuk, hogy a SerpinA1 fehérje kiválasztódik ezekből a sejtekből, és a fehérje szintje mérhető a felülúszó/sejttenyésztő közegben. Ez azt jelenti, hogy az mRNS-kódolt SerpinA1 fehérje a sejten belül összehajtódik és megfelelően módosul, hogy lehetővé tegye a szekréciót az ER-ből és a sejttenyésztő közegbe, amely az mRNS terápia kulcsfontosságú jellemzője. Az mRNS terápia segítségével a szervezet saját sejtjeit felhasználhatjuk gyárként a fehérje szintetizálására, poszttranszlációs módosítására, végül a véráramba történő szekréciójára. A sejttenyésztő táptalaj előzetes elemzése azt mutatja, hogy a szekretált SerpinA1 enzimatikusan aktív neutrofil elasztáz gátlási vizsgálatban (az adatokat nem mutatjuk be). Az 1., 2. és 3. ábrán szereplő adataink arra utalnak, hogy a SerpinA1 fehérje szintje lényegesen magasabb, mint a kiindulási vagy a negatív kontrollszint. Ezeknek a szinteknek elegendőnek kell lenniük ahhoz, hogy csökkentsék a neutrofil elasztáz aktivitását a plazmában és a tüdőben, és ezáltal megakadályozzák az aatd-re jellemző alveoláris lebomlást és emfizémát.

kiterjesztettük tanulmányainkat annak meghatározására, hogy az mRNS-kódolt SERPINA1 kifejezhető-e in vivo. Vizsgálataink azt mutatják, hogy intravénásan injektált humán SERPINA1 mRNS elérte mind a májat, mind a tüdőt WT egerekben(3(A) és 3 (b) ábra). Így a lipid-kapszulázott mRNS terápia potenciálisan megcélozhatja az AATD mindkét helyét (máj és tüdő). Ennél is fontosabb, hogy a humán SerpinA1 fehérje mind a májban, mind a tüdőben termelődött a WT egerekben (3(c) és 3(d) ábra). A serpina1 fehérje expressziós mintája a máj sinusoidjaiban azt jelzi, hogy a fehérjéket a hepatociták vagy más májsejt-típus, például a serpina1-et általában expresszáló csillagsejtek választják ki. Adataink nem zárják ki annak lehetőségét, hogy az mRNS a májsejteken kívül más májsejtekbe is belép vagy expresszálódik, és ez további munkát igényel. Lehetséges, hogy a tüdőben lévő humán SerpinA1 fehérje két forrásból származhat: a SERPINA1 mRNS-ből, amely i.v. injekcióval jutott el a tüdőbe, valamint a májban az emberi SERPINA1 mRNS által termelt szekretált humán SerpinA1-ből. Mindkét esetben ígéretes a serpina1 fehérje expressziójának és lokalizációjának lehetősége a tüdőben és a májban, mivel blokkolhatja a neutrofil elasztáz által közvetített károsodást a tüdőben, miközben csökkentheti a PIZZ formákat a májban. Ez utóbbi hipotézis karadagi et al. ahol a SerpinA1 fehérje növekedése augmentációs terápiával a PIZZ forma csökkenését mutatta az AATD beteg PBMC-jében. Ez felveti annak a lehetőségét, hogy az mRNS-kódolt SerpinA1 fehérje, amikor a májban expresszálódik, csökkentheti a Pizz forma májtermelését, majd gátolhatja a májfibrózist. A májfibrózis és az ER stressz gátlása végső soron csökkentheti/megszüntetheti az AATD beteg májátültetés iránti igényét. Hipotézisünket in vivo kell tesztelni egy aatd modellben, amely bizonyítja a májfibrózist és a hepatocelluláris karcinóma progresszióját.

bár ezek izgalmas adatok, szeretnénk rámutatni, hogy az mRNS-terápiákat javítani kell, hogy potenciálisan krónikus előnyöket nyújtsanak az AATD-betegek számára. Az exogén módon szállított mRNS jelenlegi felezési ideje jellemzően 24-48 óra a szövetekben, míg a fehérje felezési ideje a fehérjétől és annak lebontó mechanizmusaitól függően változik. Az mRNS-ek felezési idejének növelésére irányuló stratégiák jelenleg vizsgálat alatt állnak, és a korai adatok azt mutatják, hogy növelhetjük az mRNS stabilitásának időtartamát a kodon-optimalizált mRNS-t kísérő UTR-k modulálásával . A Rational protein engineering stratégiák célja a megnövekedett fehérje felezési idő megkönnyítése is, ami fokozott enzimatikus aktivitást eredményez, és végső soron az mRNS terápia adagolásának szükségességét csökkenti . Ezek az új fejlesztések olyan mRNS-terápiát eredményezhetnek, amelyet ritkán adagolnak, és elegendő enzimaktivitást tart fenn, például a SerpinA1 fehérje, hogy klinikai javulást biztosítson. Egy másik szempont, amely javítaná az mRNS-terápiákat, az LNP-szállítás biztonsága, amellyel néhány hetente adagolhatjuk az LNPs-t. A jelenlegi LNP technológia megkönnyíti a havi egyszeri adagolási rendszert, de nem támogatja a gyakoribb adagolást, ha párosítjuk az adagolást a hatékonysággal. Mint korábban említettük, az LNP-kapszulázott mRNS terápiák redosed, ellentétben néhány AAV-gén terápiával, és az adagot titrálni lehet, hogy a betegek maximális hasznot nyújtsanak.

5. Következtetés

tanulmányaink bemutatják egy új terápiás mód, az mRNS terápia lehetőségét, amelynek során egy hiányzó vagy nem funkcionális fehérje pótolható a normál funkciók elvégzéséhez. Eredményeink azt mutatják, hogy a lipid-kapszulázott mRNS a tüdőre és a májra irányulhat, amelyek az AATD betegségének két elsődleges helye. Míg az aatd mRNS-terápiáját vizsgáló korábbi tanulmányok 24 órás fehérje expressziót mutattak az A549 és a HEK293 sejtekben, tanulmányaink SerpinA1 fehérje expressziót mutatnak az AATD beteg fibroblasztjaiban és a betegből származó hepatocitákban, amelyek releváns sejtvonalak a betegség szempontjából. Ezen felül kiterjesztjük a korábbi vizsgálatokat ezen a területen annak bemutatásával, hogy a lipid-kapszulázott mRNS képes szállítani az egér májába és tüdejébe, és SerpinA1 fehérjét termel, hogy funkcionálisan releváns legyen a betegek számára. További kutatásokat kell végezni egy AATD-betegség modelljében, és biztosítani kell az mRNS többszörös adagolásának biztonságosságát rágcsálókban és magasabb rendű állatokban, mielőtt ezt a módszert emberi felhasználásra szánnák. Tanulmányaink együttesen felvetik azt az érdekes lehetőséget, hogy a SERPINA1 mRNS-t használó mRNS-terápia előnyös lehet az AATD betegek számára.

adatok rendelkezésre állása

Az ebben a cikkben közzétett összes eredményt alátámasztó adatot a cikk tartalmazza. Más adat nem áll rendelkezésre.

összeférhetetlenség

minden szerző az Alexion Pharmaceuticals, Inc.alkalmazottja és részvényese., egy olyan cég, amely ritka és ultrarare betegségek terápiáit fejleszti.

szerzői hozzájárulások

Brendan Connolly tervezte és végezte el a sejttenyészetet, a transzfekciót és az in vivo mintafeldolgozást. Cleo Isaacs tervezte és hajtotta végre az IHC-t. Lei Cheng ISH kísérleteket, kéziratírást és in vivo tanulmányokat tervezett és végzett. Kirtika H. Asrani western blotokat, immunvizsgálatokat és in vivo mintafeldolgozást végzett. Romesh R. Subramanian kísérleteket tervezett, áttekintette az adatokat és írta a kéziratot

köszönetnyilvánítások

Alexion Pharmaceuticals, Inc., elismerték a finanszírozást.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.