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Introduzione alla diagnostica del test rapido a flusso laterale

I test di flusso laterale (LFA) sono dispositivi diagnostici monouso semplici da usare che possono testare biomarcatori in campioni come saliva, sangue, urina e cibo. I test hanno una serie di vantaggi rispetto ad altre tecnologie diagnostiche, tra cui:

  • Semplicità: la semplicità di utilizzo di questi test non ha eguali: basta aggiungere alcune gocce alla porta del campione e leggere i risultati a occhio pochi minuti dopo.
  • Economico: I test sono poco costosi, in genere meno di un dollaro per test da produrre su larga scala.
  • Robusto: I test possono essere conservati a temperatura ambiente e hanno una durata pluriennale.

Miliardi di strisce reattive vengono prodotte ogni anno per la diagnosi di malattie sessualmente trasmissibili, malattie trasmesse dalle zanzare, tubercolosi, epatite, test di gravidanza e fertilità, marcatori cardiaci, test colesterolo / lipidi, droghe d’abuso, diagnostica veterinaria e sicurezza alimentare, tra gli altri.

Un LFA è costituito da un tampone campione, un tampone coniugato, una striscia di nitrocellulosa che contiene linee di test e controllo e un tampone traspirante. Ogni componente si sovrappone di almeno 1-2 mm, consentendo un flusso capillare senza ostacoli del campione.

Diagramma di prova rapido a flusso laterale

Per utilizzare il dispositivo, un campione liquido come sangue, siero, plasma, urina, saliva o solidi solubilizzati viene aggiunto direttamente al tampone del campione e viene perforato attraverso il dispositivo a flusso laterale. Il tampone del campione neutralizza il campione e filtra le particelle indesiderate come i globuli rossi. Il campione può quindi fluire senza impedimenti al cuscinetto coniugato che contiene nanoparticelle fortemente colorate o fluorescenti che hanno un anticorpo sulla loro superficie. Quando il liquido raggiunge il cuscinetto coniugato, queste nanoparticelle essiccate vengono rilasciate e mescolate con il campione. Se ci sono analiti bersaglio nel campione che l’anticorpo riconosce, questi si legheranno all’anticorpo. Le nanoparticelle legate all’analita fluiscono quindi attraverso una membrana di nitrocellulosa e attraverso una o più linee di prova e una linea di controllo. La linea di test (etichettata T nell’immagine sopra) è la lettura primaria della diagnostica e consiste in proteine immobilizzate che possono legare la nanoparticella per generare un segnale correlato alla presenza dell’analita nel campione. Il fluido continua a scorrere attraverso la striscia fino a raggiungere la linea di controllo. La linea di controllo (etichettata C nell’immagine sopra) contiene ligandi di affinità che legheranno il coniugato di nanoparticelle con o senza l’analita presente in soluzione per confermare che il test funziona correttamente. Dopo la linea di controllo, il fluido scorre nel cuscinetto traspirante che è necessario per assorbire tutto il liquido del campione per garantire che vi sia un flusso coerente attraverso le linee di prova e controllo. In alcuni test, un buffer di chase viene applicato alla porta del campione dopo l’introduzione del campione per garantire che tutto il campione venga trasportato attraverso la striscia. Una volta che tutto il campione è passato attraverso le linee di test e controllo, il test è completo e l’utente può leggere i risultati.

Casetta a flusso laterale

Il tempo di analisi dipende dal tipo di membrana utilizzata nell’analisi a flusso laterale (le membrane più grandi scorrono più velocemente ma sono generalmente meno sensibili) ed è tipicamente completo in meno di 15 minuti.

Formati di flusso laterale

I due formati di dosaggio comuni sono chiamati “sandwich” e “competitive”. Il formato di analisi sandwich viene in genere utilizzato per rilevare analiti più grandi che hanno almeno due siti di legame, o epitopi. Di solito, un anticorpo a un sito di legame viene coniugato alla nanoparticella e un anticorpo a un altro sito di legame viene utilizzato per la linea di test del test. Se è presente analita nel campione, l’analita si legherà sia al coniugato anticorpo-nanoparticella che all’anticorpo sulla linea di prova, producendo un segnale positivo. Il formato sandwich determina un’intensità del segnale sulla linea di prova direttamente proporzionale alla quantità di analita presente nel campione. Indipendentemente dalla quantità di analita nel campione, un anticorpo anti-specie sulla linea di controllo legherà la nanoparticella, producendo un forte segnale di linea di controllo che dimostra che il test funziona correttamente.

Sandwich Competition Later Flow Rapid Test Immunoassay

Il formato competitivo viene utilizzato per rilevare analiti quando le coppie di anticorpi non sono disponibili o se l’analita è troppo piccolo per eventi di legame anticorpale multipli, come steroidi e farmaci. In questo formato, la linea di test contiene tipicamente la molecola di analita, di solito un complesso proteina-analita, e il cuscinetto coniugato contiene il coniugato anticorpo-nanoparticelle di rilevamento. Se l’analita bersaglio è presente, l’analita si legherà al coniugato e impedirà che si leghi all’analita sulla linea di prova. Se l’analita non è presente, i coniugati si legheranno all’analita sulla linea di prova, producendo un segnale. Nel formato competitivo, l’intensità del segnale è inversamente proporzionale alla quantità di analita presente nel campione. Come nel formato sandwich, la linea di controllo legherà il coniugato di nanoparticelle con o senza l’analita fornendo la certezza che il test funzioni correttamente.

Le nanoparticelle come reporter nel flusso laterale

I test di flusso laterale standard generano un segnale ottico che deriva da particelle fortemente colorate legate a linee di prova su una striscia di nitrocellulosa bianca. Questo segnale può essere letto a occhio (qualitativo o semi-quantitativo) o da uno strumento (quantitativo). Per massimizzare la sensibilità del dispositivo, ogni evento di associazione dovrebbe produrre il segnale più forte possibile. Le particelle più grandi forniranno un segnale più forte per ogni evento di legame e saranno più facili da vedere, ma le particelle troppo grandi non fluiranno facilmente attraverso la membrana e avranno quindi limitate opportunità di legarsi alla linea di test. Pertanto, le particelle con dimensioni comprese tra 20 nm e 500 nm vengono tipicamente selezionate per lo sviluppo del dosaggio del flusso laterale. Le particelle fluorescenti possono anche essere impiegate e si applicano le stesse regole generali: più potente è la fluorescenza per evento di legame, più forte è il segnale.

Una delle particelle reporter più comuni utilizzate nei test di flusso laterale sono nanoparticelle d’oro di diametro 40 nm. Le nanoparticelle d’oro hanno proprietà ottiche insolite che le rendono eccezionalmente forti assorbitori di luce. l’oro del diametro di 40 nanometro ha un’assorbanza di punta a ~ 520 nanometro, con conseguente forte linea di prova colorata rosso rubino. La superficie dorata lega fortemente anticorpi e altre proteine, consentendo la semplice fabbricazione di robusti coniugati nanoparticelle-anticorpi. Altre dimensioni e forme di nanoparticelle sono state utilizzate anche come sonde di flusso laterale. Le nanoshell d’oro con un diametro di 150 nm forniscono un contrasto più elevato per evento di legame e in genere forniscono un aumento di sensibilità di 3-20 volte rispetto alle particelle d’oro di 40 nm. A causa del nucleo di silice, le nanoshell d’oro sono meno dense di una particella d’oro solido e sono in grado di fluire senza ostacoli attraverso la membrana di nitrocellulosa. Poiché la nanoshell d’oro ha la stessa superficie d’oro delle nanoparticelle d’oro massiccio più piccole, sono necessarie solo modifiche minori del protocollo per passare dalle nanosfere d’oro massiccio alle nanoshell d’oro. A nanoComposix, la linea BioReady di nanoparticelle d’oro è specificamente progettata per fabbricare coniugati di alta qualità che possono essere utilizzati per il flusso laterale.

Analisi del flusso laterale

I risultati di una prova del flusso laterale possono essere qualitativi (“sì / no”), semi-quantitativi o quantitativi. Il test di gravidanza è un esempio di un test qualitativo sì/no, in cui un segnale di linea di test positivo è correlato a livelli elevati dell’ormone hCG nelle urine, indicando che l’utente è incinta. Per la diagnostica quantitativa, le intensità della linea di prova vengono confrontate con uno standard di calibrazione e convertite in un valore di concentrazione di analita. Per misurare con precisione l’intensità della linea di prova, il risultato LFA deve essere analizzato da un lettore di strisce. La recente commercializzazione di piccolo fattore di forma, poco costoso, lettori mobile-centric è pronta a trasformare il settore LFA, come semplici metodi di quantificare la produzione di LFA senza l’uso di stand-alone lettori da banco apre una straordinaria opportunità per l’uso domestico di point-of-care diagnostica. Il lettore mostrato di seguito è un nuovo prodotto di Lumos Diagnostics in cui una striscia viene inserita in una cartuccia, l’intensità del segnale sulla striscia viene analizzata con un fotodiodo e i risultati vengono inviati a un telefono cellulare per visualizzare il risultato. La curva di calibrazione per ogni dato test è integrata nel software per quel test, in modo che la lettura della linea di test possa essere automaticamente convertita in una concentrazione di massa per l’analita e un risultato finale sia presentato all’utente.

Lumos diagnostica disposible bluetooth reader

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