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Α-1アンチトリプシン欠損症の治療法としてのSERPINA1mRNA

Abstract

Α-1-アンチトリプシン(AAT)欠損症は、AATをコードするSERPINA1遺伝子の変異に起因する不活性/欠陥AATを産生する遺伝性疾患である。 この疾患は、肺におけるAATの活性の低下および肝臓における過剰な欠損AATタンパク質の沈着と関連している。 現在、AAT欠乏症に関連する肝疾患のための具体的な治療法はありません。 AAT肺疾患は、多くの場合、いくつかの血清タンパク質代替製品のいずれかで治療されます; しかし、Serpina1補充療法の有効性に関する長期的な研究は利用できず、AAT欠乏症における肝障害を軽減するものではない。 mRNA療法は、AAT欠損患者の肝臓および肺の両方を潜在的に標的とする可能性がある。 AAT患者線維芽細胞およびAAT患者線維芽細胞由来肝細胞はSERPINA1コードmRNAと細胞培養培地Serpina1発現のためにテストされたトランスフェクトされました。 我々のデータは、処理されたAAT患者線維芽細胞およびAAT患者線維芽細胞由来肝細胞からの培養培地中の増加Serpina1タンパク質を示しています。 野生型マウスにおけるin vivoでの研究は、肝臓および肺におけるSERPINA1mRNAの生体分布だけでなく、批判的にAAT欠乏症に影響を受けているこれら二つの標的 まとめると、我々のデータは、Serpina1mRNA療法がAAT欠乏症に罹患している患者に利益をもたらす可能性を有することを示唆している。

1. はじめに

Α-1-アンチトリプシン欠乏症(AATD)は、適切な治療法がない壊滅的な病気です。 現在の治療法は肺を保護するだけであり、進行した症例では血漿由来のAATタンパク質の頻繁な静脈内注射を必要とする。 AATD患者は、閉塞性肺疾患および肝疾患(例えば、小児および成人における肝硬変および肝細胞癌)の素因がある。 慢性閉塞性肺疾患(COPD)と診断された患者の約1-5%は、α-1-アンチトリプシン欠乏症を有すると推定されている。 非常にまれな間、AATDの子供の気腫は報告され、肝臓病の発生は年齢と増加します。 重度の症状は、特に喫煙者では、人生の後半に発生します。 AATDの肝臓の徴候は生命に遅く見られ、頻繁にレバー移植を必要とします。 AATDはSERPINA1遺伝子内の突然変異によって引き起こされる受継がれた病気です。 SERPINA1遺伝子は、M対立遺伝子として指定された2つの対立遺伝子を有する(正常な患者は、MM遺伝子型を有する)。 重度のAAT欠乏症を生じる最も一般的な対立遺伝子は、Z(E342K)と呼ばれます。 重度のAATD患者の95%がZZの遺伝子型を有し、Serpina1血清レベルのわずか10〜20%を有することが報告されている。 ZZの突然変異の場合ではSerpina1蛋白質はきちんと折ることができないし、hepatocytesによって分泌しません;従ってAATDは蛋白質機能蛋白質を分泌する無力を作 肝細胞におけるZZ Serpina1の蓄積は、重度の肝障害をもたらす。 ホモ接合体は非常に一般的であり、北米とヨーロッパでは1:2500-3000の出生に発生する。Α-1-アンチトリプシン(AAT)は、SERPINA1(セリンプロテアーゼ阻害剤、グループA、メンバー1)としても知られており、主に肝細胞によって産生される分泌タンパク質であり、単核食細胞、好中球、および気道/腸上皮細胞によってより小さい程度まで産生される。 Serpina1はまた水溶性およびティッシュの拡散性の循環の糖蛋白質です。 Serpina1の主要な役割はセリンプロテアーゼの規則であり、この行為の主要な場所は肺にあります。 そこでセルピナ1は好中球エラスターゼと結合して不活性化し、炎症反応の際に肺胞組織をタンパク質分解分解から保護する。 Serpina1は最も豊富な循環の反プロテアーゼであり、Serpina1の正常な血しょう集中は通常1-2g/L.に達します。

AATDは、血液および組織中のSerpina1の濃度および活性を低下させる肝細胞の粗小胞体中の誤った折り畳まれたSerpina1タンパク質の重合を特徴とする。 重度の欠乏症の患者では、Serpina1血清レベルは50mg/dL以下であり、正常レベルは200mg/dLである。 循環Serpina1の低レベルでは、肺は好中球エラスターゼ、肺胞を破壊し、肺疾患を引き起こす酵素から保護されていません。 したがって、AATDの最も頻繁な臨床合併症は、肺気腫および肝疾患である。

これまでのところ、AAT増強療法のみがAATDの治療に利用可能である。 AATの増加療法は1987年に開発され、厳しいAATD関連肺気腫の指定患者の商業使用のために現在だけ承認されます。 AATの増加は好中球のエラスターゼの損傷を防ぐのを助けることができる肺にSerpina1を供給するのを助けるだけです。 血清欠乏症は肝障害の原因ではないので、AATDに関連する肝疾患に罹患している患者のための特定の治療法はない。 唯一の治療法は、典型的な肝不全に対する支持療法と、非代償性肝硬変患者に対する肝移植である。AATDは、mRNA治療の理想的な標的となる単遺伝子障害である。

AATDは、mRNA治療のための理想的な標的となる単遺伝子障害である。 mRNAは、従来の生物学的および酵素置換治療法よりもその巨大な柔軟性のために、幅広い疾患に潜在的に適用可能である新規なモダリティである。 mRNAベースの治療薬は、以前に標的とされていない疾患のための治療薬の開発を可能にする、標的タンパク質の生産と翻訳後修飾のために宿主細胞の内 我々は、外因的にコードされたSerpina1を発現し、適切な臓器にmRNA/タンパク質を標的とすることができるかどうかを決定するためにin vitroおよびin vivo研究を行mRNA療法は、AAT欠損患者の肝臓および肺の両方を潜在的に標的とする可能性がある(現在の実験は保留中)。

mRNA療法は、AAT欠損患者の肝臓および肺の 我々のデータは、治療AAT患者線維芽細胞の細胞培養培地だけでなく、AAT患者線維芽細胞由来の一次肝細胞の細胞培養培地で増加Serpina1タンパク質を示した。 さらに、静脈内注射を介してSERPINA1mRNAを受けているWT動物では、SERPINA1mRNAおよびSerpina1タンパク質の両方が肝臓および肺の両方に局在することが観察された。 一緒に取られて、我々のデータは、肺のSerpina1タンパク質のmRNAを介した発現は、それが肝臓でMMアイソフォーム発現を促進し、AAT患者のための利益の複数のルー

2. 材料および方法

2.1. AATD患者線維芽細胞

細胞培養条件。 以下の患者線維芽細胞は、Coriell Institute for Medical Research,Cell Repository(Camden,NJ)から入手した。: AATD患者の肝臓からのGM1 1 4 2 3およびGM1 2 4 4 5およびAATD患者の皮膚からのGM0 2 5 2 2および皮膚からの正常対照線維芽細胞ラインND3 4 7 6 9。 細胞をEagle’S minimum Essential Medium中で、Earle’s saltsおよび非必須アミノ酸(Thermo Fisher Scientific,Inc. Waltham,M A)に1 5%ウシ胎児血清を補充し、5%CO2中で3 7℃でインキュベートした。

トランスフェクション条件。 患者の線維芽細胞は2でトランスフェクトされました。各mRNAの5μ gおよび4μ lのmrna−in脂質トランスフェクション試薬(MTI−Globalstem,Gaithersburg,M D)を、実験ごとに3つの生物学的複製物を用いた3つの独立した実験で用いた。 5μ gに希釈した(Thermo Fisher Scientific,Inc. Waltham,M A)および同様に適切な量のmRNA−Inを、ウェル当たりOptimem中で希釈し、製造業者の推奨に従ってプロトコールに従った。 希釈したmRNAを希釈した脂質と混合し、細胞に添加する前に室温で1 5分間インキュベートさせた。 患者の線維芽細胞にmRNA−脂質混合物を添加した後、細胞を5%CO2で3 7℃でインキュベーターに戻した。 2 4時間後に、細胞をPBSで2回穏やかに洗浄し、1Xプロテアーゼ阻害剤(Sigma−Aldrich,St.louis,MO)を含む新鮮なRIPA緩衝液(Sigma−Aldrich,St.louis,MO)中で溶解した。5mlチューブ(Eppendorf,Hamburg,Germany)中に採取し、1 8 0 0 0xgで4℃で遠心分離して、細胞残屑を除去した。</p><p>細胞溶解および全タンパク質定量:患者の線維芽細胞溶解物を、0. 遠心分離後、透明な上清を慎重に別の標識管に移し、氷上に置いた。 全タンパク質濃度は、BC a assay kit(Thermo Fisher Scientific,Inc.、Waltham、MA)製造業者の議定書に従って96井戸のフォーマットの重複して。

SERPINA1発現のためのWes自動化されたキャピラリー電気泳動。 タンパク質濃度0.4mg/mLでそれぞれ5μ lの最終サンプルを、Protein Simple Wes manufacturerの指示に従って調製した。 溶解物を、Proteinsimple wesサイズベースの毛細管電気泳動システム(Proteinsimple Wes;Proteinsimple,San Jose,C A)を使用して分析した。 サイズ分離されたタンパク質を、1:1 2 5希釈でのSERPINA1に特異的な抗体(Novus Nbp1−9 0 3 0 9,Novus Biologics,Littleton,C O)および1:1 0 0 0でのハウスキーパーのチオレドキシン(CST2 4 2 9,Cell Signaling Technologies Inc. 標識されたウサギ二次抗体を使用して視覚化し、製造業者のソフトウェアを使用して定量化した。 各レーンについて、SERPINA1の曲線下面積(AUC)を、チオレドキシン対照のAUCに正規化した。

2.2. Α-1アンチトリプシン欠損肝細胞

細胞培養条件。 AATD患者由来肝細胞は、独自の分化プロトコルを使用してDefinigen(Cambridge UK)によってAATD線維芽細胞から生成された。 細胞をDTM培地およびDRM培地(Definigen,Cambridge UK)中で増殖させ、2 4ウェルプレート中で1ウェル当たり5 0 0,0 0 0細胞で播種した。 細胞を、3 7℃の低酸素条件下で、5%CO2および5%O2中で増殖させ、培地を2日ごとに変えて、独自の製造業者のプロトコール(Definigen、Cambridge UK)に基づいてトランスフェク 細胞は、製造業者の指示に従って低酸素条件下で増殖させ、細胞増殖を可能にしたが、非低酸素条件下では細胞増殖を減少させた。

トランスフェクション条件およびELISAによるタンパク質発現。 AATD肝細胞を、4μ lのLipofectamine(登録商標)2 0 0 0(Thermo Fisher Scientific,Inc.、ウォルサム、マサチューセッツ州)あたり2。実験ごとの3つの生物的複製との3つの独立した実験の5ug mRNA。 次いで、細胞を2 4、4 8、および7 2時間インキュベートした後、細胞培養培地を除去し、Abcam(Cambridge、M A)からのELISAを使用し、製造業者のプロトコールに従ってSerpina1タンパク質濃度2.3.

In Vivo Studies

すべての実験、動物の収容、取り扱い、および実験手順/プロトコルは、Alexion Pharmaceuticals Inc.に従って承認され、実行されました。 IACUCのガイドラインと規制。 C57BL/6雄マウス(6週齢)は、この研究で使用されました。 マウスは、標準的な食事と水ad libitumで、12-h/12-h明暗サイクルで温度制御された環境に保たれました。

脂質ナノ粒子へのmRNAの製剤化およびIn Vivo投与。

mRNA構築物は、SERPINA1mRNAを含む自己組織化イオン化脂質ナノ粒子(LNP)を使用して処方された。 この実験では、MRNA負荷ビヒクル対照としてGFPを使用し、pbsを陰性対照として使用した。mRNAをコードするGFPは、mRNA負荷ビヒクル対照として使用された。 LNPsは、pH4で酢酸緩衝液中のmRNAの迅速な混合によって調製した。エタノール中に約1 1(wt/wt)の脂質対薬物比で懸濁させた、脂質混合物、Hepato9mRNA kit(Precision Nanosystems)を用いて0を達成した。 動物に、1.5mg/kgの製剤化されたmRNAの単回静脈内投与量を尾静脈を通して注射した。 注射の24時間後に動物を屠殺し、組織を固定し、in situハイブリダイゼーション(ISH)および免疫組織化学(IHC)のために処理した。

サンプル収集とFFPEサンプル調製。 動物を剖検し、左側葉を組織カセット中に平らに配置した(Fisher Scientific)。 次いで、カセットを、1 0%中性緩衝ホルマリン、NBF(Sigma)固定液で満たされた容器に、固定液に対する組織容積の最小1:2 0比で入れた。 サンプルは室温で最低24hしかし48hより多くのために固定しないために許可されました。 組織固定後、カセットをPBSで満たされた容器の中に3日以内に入れた。 PBS洗浄後、肝臓組織を処理し、パラフィンブロックに埋め込んだ。2.4.

免疫組織化学およびIn Situハイブリダイゼーション手順

SERPINA1の免疫組織化学は、SERPINA1(アトラス、HPA001292at1:100)に対する抗体を用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋、5μ m 免疫染色は、Leica BOND R Xプラットフォーム(Leica Biosystems,Leica Microsystems Inc.,Buffalo Grove,IL)を適切な陽性対照を有する標準プロトコルに従った。 Leica BOND R Xプラットフォーム上の標準的な抗原検索は、Leica ER1、EDTA−Tris、pH8. スライドを段階的エタノール系列で脱水し,キシレン中でクリアし,サイトシールを用いて取り付けた。 スライドは、VS1 2 0システムを使用して、4 0倍の倍率(Olympus)で撮像した。

mRNA可視化のために、in situハイブリダイゼーション(ISH)を行った。 カスタムRNA in situハイブリダイゼーションプローブ(Affymetrix,Santa Clara,C A)を、SERPINA1mRNAを検出するように設計した。 自動化RNA ISHアッセイは、Viewrna E Z−L検出キット(Affymetrix,Santa Clara,C A)およびLeica BOND R Xプラットフォーム(Leica Biosystems,Leica Microsystems Inc. Buffalo Grove,IL)を使用した。 ホルマリン固定、パラフィン包埋(FFPE)組織は、ガラススライド上に5umの厚さで調製し、ライカ結合RX上に置いた。 1:1 0 0 0希釈(Leica Biosystems,Buffalo Grove,IL)中で9 5℃で1 0分間インキュベーションした後、BOND Enzyme Preformation KitからのプロテイナーゼKとの2 0分間インキュベーションで、2:1 0 0 0希釈(Leica Biosystems,Buffalo Grove,IL)で、RNAをマ ハイブリダイゼーションは、FASTRED検出に続いてSERPINA1 1:40プローブ希釈で行った。 RNAの整合性とアッセイ手順を確保するために、追加のセクションは、ペプチジルプロリルイソメラーゼB(PPIB)、ISHの陽性対照として使用される内因性ハウスキーピングタンパク質のためのプローブとハイブリダイズされました。 非特異的染色を制御するために,細菌蛋白質ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapb)に対する制御プローブを陰性対照として用いた。 全てのプローブは1:4 0希釈であった。 スライドを空気乾燥し、キシレン中でクリアし、Cytosealを使用して取り付けた。 スライドは、VS1 2 0システムを使用して、4 0倍の倍率(Olympus)で撮像した。

3. 結果

3.1. 細胞溶解物および患者線維芽細胞および患者線維芽細胞由来の一次肝細胞の細胞培地におけるmRNA由来ヒトSerpina1発現

TriLinkからのヒトSERPINA1mRNAを、Coriell Instituteから得られたAATD患者線維芽細胞にトランスフェクトした。 ヒトSerpina1タンパク質発現の有意な増加は、野生型(WT)またはフラグタグ(FT)Serpina1のトランスフェクション時に細胞溶解物(図1(a))および細胞培養培地(図1(b))

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Figure 1
In vitro human SerpinA1 expression in cell lysates (a) and cell media (b) from AATD patient fibroblasts and normal skin fibroblasts. Vehicle control is GFP mRNA; WT-SERPINA1 is WT mRNA sequence; FT-SerpinA1 is flag-tagged mRNA sequence.

ヒトSERPINA1mRNAトランスフェクションは、DefiniGenから得られた患者線維芽細胞由来の初代肝細胞においても実施した。 培地へのWT Serpina1タンパク質の分泌は、ビヒクルのみGFP mRNAコントロールと比較して24hで増加した。 我々は、トランスフェクション後の48hおよび72hで見られるように、時間の経過とともにSerpina1タンパク質発現の一貫した増加を観察した(図2)。

Figure 2
In vitro human SerpinA1 expression in cell culture media obtained from patient fibroblast-derived hepatocytes (DefiniGen, Cambridge UK).

3.2. In Vivo Human SerpinA1 Expression in WT Mice

Human SerpinA1 protein expression was subsequently evaluated in WT C57bl/6 mice. ヒトSERPINA1mRNAは肝臓で観察された(図3(a))が、mRNAが脂質ナノ粒子に封入されており、一般に肝臓に大量の貨物を送達することを考えると予想されるように。 興味深い発見は、マウスの肺にもSERPINA1mRNAが検出されたことでした(図3(b))。 Serpina1タンパク質発現は、ヒト特異的Serpina1抗体を用いて検出された。 Serpina1タンパク質は、肝臓(図3(c))と肺(図3(d))の両方に見られた。 肝臓におけるSerpina1タンパク質発現の正弦分布パターンは、Serpina1タンパク質がおそらく肝細胞によって血液中に分泌されていることを示している。div>

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インビボでヒトセルピナ1mrnaは、肝臓(a)およびwt mippa24hの肺(b)に二分配され、i.v.がish反対に解毒された後。 画像の赤い点はmRNAを表します。 Serpina1タンパク質は、ihcによって肝臓(c)および肺(d)で視覚化された。

4. ディスカッション

AATDは、患者に利益をもたらすための効率的な治療法の必要性を持つ壊滅的な病気です。 現在の増強療法は、AATD患者の肝臓への長期的な損傷を避けるには不十分である。 現在、多くのグループは、遺伝子治療などの多くの必要な治療法を提供するために新しいモダリティを追求しています。 例えば、骨髄由来幹細胞移植は、AATDマウスで試験され、肝細胞の劣化のいくつかの救助を実証されています。 遺伝子置換戦略はまた、WT SERPINA1遺伝子が肝臓に挿入され、適切なSerpina1タンパク質を発現する診療所で試験されている。 現在の方法は、依然として最適化される必要があり、A AV媒介遺伝子送達は、抗体媒介性タンパク質分泌の減少またはウイルスカプシドに対する免疫学的反応を引き起こす可能性がある。

肝臓へのmRNA送達は比較的簡単であり、脂質ナノ粒子(LNP)を介して確立され、我々は有意な免疫反応なしにLNPカプセル化mRNAを投与することができると 最初に我々は、AATD患者線維芽細胞および患者線維芽細胞由来の原発性肝細胞における我々の仮説をテストした。 我々のデータは明らかに我々はmRNAとSERPINA1をコードし、その後、両方の細胞型からSerpina1タンパク質を発現することができることを示しています。 我々はまた、Serpina1タンパク質がこれらの細胞から分泌され、タンパク質レベルが上澄み/細胞培養培地中で測定できることを実証する。 これは、mRNAコードされたSerpina1タンパク質が折り畳まれ、ERからこのmRNA療法の重要な特徴である細胞培養培地への分泌を可能にするために細胞内で適切 MRNA療法を利用することで、体内の細胞を工場として利用してタンパク質を合成し、翻訳後に改変し、最終的に血流に分泌することができます。 細胞培養培地の予備分析は、分泌されたSerpina1が好中球エラスターゼ阻害アッセイにおいて酵素的に活性であることを示す(データは示さない)。 図1、2、および3の我々のデータは、Serpina1タンパク質のレベルがベースラインまたは陰性対照レベルよりも有意に高いことを示唆している。 これらのレベルは血しょうおよび肺の好中球のエラスターゼの活動を減らし、それによりAATDの特徴である肺胞の低下および気腫を防ぐのに十分であ

我々は、mRNAコードされたSERPINA1がin vivoで発現することができるかどうかを決定するために我々の研究を拡張しました。

我々の研究は、静脈内注射されたヒトSERPINA1mRNAがWTマウスの肝臓と肺の両方に到達したことを示している(図3(a)と3(b))。 したがって、脂質カプセル化mRNA療法は、潜在的にAATD(肝臓と肺)の両方のサイトを標的とすることができます。 さらに重要なことに、ヒトSerpina1タンパク質は、WTマウスの肝臓および肺の両方で産生された(図3(c)および3(d))。 肝シヌソイドにおけるSerpina1タンパク質発現パターンは、タンパク質が肝細胞または通常SERPINA1を発現する星状細胞などの別の肝細胞型によって分泌されていることを示している。 我々のデータは、mRNAが肝細胞以外の他の肝細胞に入るか、または発現される可能性を排除することはできず、これにはさらなる研究が必要である。 肺内のヒトSerpina1タンパク質は、静脈内注射を介して肺に到達したSERPINA1mRNAと、肝臓内のヒトSERPINA1mRNAによって産生された分泌されたヒトSerpina1の2つの供給源か いずれの場合も、肺および肝臓におけるSerpina1タンパク質の発現および局在化の可能性は、肺の好中球エラスターゼを介した損傷をブロックし、肝臓のPIZZ形態を減少させる可能性があるため有望である。 後者の仮説は、Karadagiらの研究に基づいている。 ここで、増強療法によるSerpina1タンパク質の増加は、AATD患者PBMCにおけるPIZZ形態の減少を示した。 これは、mRNAコードSerpina1タンパク質は、肝臓で発現されたとき、PIZZフォームの肝臓産生を減少させ、その後、肝線維症を阻害する可能性を提起する。 肝線維症およびERストレスの阻害は、最終的にaatd患者の肝臓移植の必要性を減少/排除する可能性がある。 我々の仮説は、肝線維症と肝細胞癌への進行を示すAATDモデルでin vivoでテストする必要があります。これらは刺激的なデータですが、aatd患者に慢性的な利益をもたらす可能性があるためには、mRNA療法を改善する必要があることを指摘したいと思います。

外因的に送達されたmRNAの現在の半減期は、典型的には組織中で24〜48hであるが、タンパク質の半減期はタンパク質およびその分解機構に依存して異な Mrnaの半減期を増加させるための戦略は、現在調査中であり、初期のデータは、我々はコドン最適化mRNAに隣接するUtrを調節することにより、mRNAの安定性の持続 合理的なタンパク質工学戦略はまた、増加した酵素活性をもたらし、最終的にmRNA療法の投与の必要性を減少させるタンパク質半減期の増加を促進 これらの新規な改善は、まれに投与され、臨床的改善を提供するために、例えばSerpina1タンパク質の十分な酵素活性を維持するmRNA療法をもたらす可能性があ MRNA療法を改善する別の態様は、数週間ごとにLnpを投与することができるLNP送達の安全性である。 現在のLNPの技術は私達が効力と投薬を組合わせれば月に一度投薬の政体を促進しますが、より頻繁な投薬を支えません。 先に述べたように、LNP封入m RNA療法は、いくつかのA AV遺伝子療法とは異なり、再投与することができ、最大の患者利益を提供するために用量を滴定する

5. 結論

私たちの研究は、不足しているか、機能していないタンパク質が正常な機能を実行するために置き換えることができる新しい治療モダリティ、mRNA療法の可能性を提示します。 脂質封入mrnaは,AATDにおける疾患の二つの主要部位である肺および肝臓を標的とすることができることを示した。 AATDのmRNA療法を探索する以前の研究は、A549およびHEK293細胞における24hでタンパク質発現を示しているが、我々の研究は、疾患に関連する細胞株であるaatd患者線維芽細胞および患者由来肝細胞におけるSerpina1タンパク質発現を示している。 さらに、我々は、脂質カプセル化されたmRNAがマウスの肝臓および肺に送達し、患者に機能的に関連するSerpina1タンパク質を産生することができることを示 さらなる研究は、ヒトの使用のためにこのモダリティを検討する前に、齧歯類および高等動物におけるmRNAの複数投与の安全性を確保するために、AATD病 まとめると、我々の研究は、SERPINA1mRNAを利用したmRNA療法がAATD患者にとって有益である可能性があるという興味深い可能性を提起する。

データの可用性

この記事で公開されている結果をサポートするすべてのデータは、記事に記載されています。 利用可能な他のデータはありません。

利益相反

すべての著者はAlexion Pharmaceuticals,Inc.の従業員および株主です。、希少疾患および超希少疾患の治療法を開発する会社。

著者の貢献

Brendan Connollyは、細胞培養、トランスフェクション、およびin vivoサンプル処理を設計し、実施しました。 クレオ-アイザックスはIHCを設計し、実施した。 Lei ChengはISHの実験、原稿の執筆および生体内の調査を設計し、遂行した。 Kirtika H.Asraniは、ウェスタンブロット、免疫アッセイ、およびin vivoサンプル処理を行った。 Romesh R.Subramanianは実験、レビューデータ、および執筆原稿を設計しました

謝辞

Alexion Pharmaceuticals,Inc.、資金調達のために認められています。

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