Articles

SERPINA1 mRNA Som Behandling for Alfa-1 Antitrypsinmangel

Abstrakt

Alfa-1-antitrypsin (AAT) mangel er en genetisk lidelse som produserer inaktiv / defekt AAT på grunn av mutasjoner i SERPINA1-genet som koder FOR AAT. Denne sykdommen er forbundet med redusert aktivitet AV AAT i lungene og avsetning av overdreven defekt aat-protein i leveren. For tiden er det ingen spesifikk behandling for leversykdom forbundet med aat-mangel. AAT lungesykdom blir ofte behandlet med en av flere serumproteinerstatningsprodukter; imidlertid er langsiktige studier av effektiviteten Av serpina1-erstatningsterapi ikke tilgjengelig, og det reduserer ikke leverskade i aat-mangel. mRNA-behandling kan potensielt målrette både leveren og lungene til PASIENTER med AAT-mangel. Aat-pasientfibroblaster og aat-pasientfibroblast-deriverte hepatocytter ble transfisert MED SERPINA1-kodende mRNA og cellekulturmedier ble testet for SerpinA1-uttrykk. Våre data viser økt SerpinA1-protein i kulturmedier fra behandlede aat-pasientfibroblaster og aat-pasientfibroblast-avledede hepatocytter. In vivo studier på villtype mus viser SERPINA1 mRNA biodistribusjon i lever og lunger, samt SerpinA1 proteinuttrykk i disse to målorganene som er kritisk påvirket av aat-mangel. Samlet sett tyder våre data på At SerpinA1 mRNA-terapi har potensial til å være til nytte for pasienter som lider av aat-mangel.

1. Innledning

Alfa-1-antitrypsinmangel (AATD) er en ødeleggende sykdom med mangel på adekvate terapier. Nåværende behandlinger beskytter kun lungene og i avanserte tilfeller krever hyppige intravenøse injeksjoner av plasmaderivert aat-protein. Pasienter med AATD er predisponert for obstruktiv lungesykdom og leversykdom (f .eks. cirrhose og hepatocellulært karsinom hos barn og voksne). Omtrent 1-5% av pasientene med diagnostisert kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) anslås å ha alfa-1-antitrypsinmangel . Selv om det er ekstremt sjeldent, har emfysem hos barn med AATD blitt rapportert, og forekomsten av leversykdom øker med alderen . Alvorlige symptomer oppstår senere i livet, spesielt hos røykere. Hepatiske symptomer på AATD ses sent i livet og krever ofte levertransplantasjon. AATD er en arvelig sykdom forårsaket av mutasjoner i SERPINA1 genet . SERPINA1-genet har to alleler betegnet Som M-alleler (normale pasienter har EN MM-genotype). DET vanligste allelet som resulterer i alvorlig aat-mangel kalles Z (E342K). Det har blitt rapportert at 95% av alvorlige aatd-pasienter har en genotype AV ZZ og har bare 10-20% Av SerpinA1 serumnivåer . I TILFELLER AV zz-mutasjon Kan serpina1-proteinet ikke foldes ordentlig og vil ikke bli utskilt av hepatocytter; DERFOR er AATD ikke forårsaket av manglende evne til å lage protein, men manglende evne til å utskille funksjonelt protein. Akkumuleringen AV Zz SerpinA1 i hepatocytter resulterer i alvorlig leverskade . HOMOZYGOT PIZZ er ganske vanlig og forekommer i 1:2500-3000 fødsler I Nord-Amerika og Europa.Alfa-1-antitrypsin (Aat), også kjent som SERPINA1 (serinproteasehemmer, gruppe a, medlem 1), er et utskilt protein som hovedsakelig produseres av hepatocytter og i mindre grad av mononukleære fagocytter, nøytrofiler og epitelceller i luftveiene/tarmene . SerpinA1 er et sirkulerende glykoprotein som også er vannløselig og vev diffuserbart . Serpina1s primære rolle er serinproteaseregulering, og hovedstedet for denne handlingen er i lungene. Der binder SerpinA1 og inaktiverer nøytrofil elastase og beskytter dermed alveolært vev fra proteolytisk nedbrytning under inflammatoriske responser . SerpinA1 er den mest omfattende sirkulerende antiproteasen, og normale plasmakonsentrasjoner av SerpinA1 når vanligvis 1-2 g / L .

AATD kjennetegnes ved polymerisering av misfoldede serpina1-proteiner i det grove endoplasmatiske retikulum av hepatocytter som reduserer konsentrasjon Og aktivitet Av SerpinA1 i blod og vev . For pasienter med alvorlig mangel er SerpinA1 serumnivåer under 50 mg / dL mens normale nivåer er på 200 mg / dL. Med lave Nivåer av sirkulerende SerpinA1 er lungene ikke beskyttet mot nøytrofil elastase, et enzym som ødelegger alveoler og forårsaker lungesykdom. Derfor er de vanligste kliniske komplikasjonene AV AATD lungemfysem og leversykdom .

Til dags dato er BARE aat augmentation therapy tilgjengelig for behandling av AATD. Aat augmentation therapy ble utviklet i 1987 og er foreløpig kun godkjent for kommersiell bruk hos utvalgte pasienter med alvorlig aatd-relatert lungeemfysem . Aat augmentation bidrar bare til å levere SerpinA1 til lungene der det kan bidra til å forhindre nøytrofil elastase skade. Siden serummangel ikke er årsaken til leverskade, er det ingen spesifikk behandling for pasienter som lider av leversykdom forbundet med AATD. Den eneste behandlingen er støttende behandling for typisk leversvikt og levertransplantasjon for pasienter med dekompensert cirrhose .

AATD er en monogen lidelse som gjør den til et ideelt mål for mRNA-terapi. mRNA er en ny modalitet som er potensielt anvendelig for et bredt spekter av sykdommer på grunn av sin enorme fleksibilitet over tradisjonelle biologiske og enzymutskiftningsterapeutika. mRNA-baserte terapeutiske midler bruker vertscellens endogene maskineri for produksjon og posttranslasjonell modifikasjon av målproteiner, noe som muliggjør utvikling av terapeutiske midler for sykdommer som ikke tidligere er målbare. Vi gjennomførte in vitro og in vivo studier for å avgjøre om vi kunne uttrykke eksogent kodet SerpinA1 og målrette mRNA / proteinet til riktig organ.

mRNA-terapi kan potensielt målrette både leveren og lungene til AAT-mangelfulle pasienter (ventende nåværende eksperimenter). Våre data viste økt SerpinA1-protein i cellekulturmedier av behandlede aat-pasientfibroblaster, så vel som i cellekulturmedier av aat-pasientfibroblast-avledede primære hepatocytter. VIDERE ble DET observert at BÅDE serpina1 mRNA og serpina1-protein hos WT-dyr som fikk serpina1 mRNA via intravenøs injeksjon, var lokalisert i både lever og lunger. Samlet sett tyder våre data på at mRNA-mediert uttrykk For SerpinA1-protein i lungene kan hemme nøytrofil elastase, mens det kan fremme MM isoformuttrykk i leveren og gi flere fordeler for aat-pasienter.

2. Materialer og Metoder

2.1. Aatd Pasient Fibroblaster

Cellekultur Forhold. Følgende pasientfibroblaster ble oppnådd Fra Coriell Institute For Medical Research, Cell Repository (Camden, NJ): GM11423 OG GM12445 fra aatd pasientlever og GM02522 fra aatd pasient hud og normal kontroll fibroblast linje ND34769 fra huden. Celler ble dyrket I Eagle ‘S Minimum Essensielle Medium med Earle’ s salter og ikke-essensielle aminosyrer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) supplert med 15% føtalt bovint serum og inkubert ved 37°C i 5% CO2.

Transfeksjonsforhold. Pasientfibroblaster ble transfisert med 2.5ug av hver mRNA og 4 µ av mRNA-In lipidtransfeksjonsreagenset (Mti-GlobalStem, Gaithersburg, MD), i 3 uavhengige eksperimenter med 3 biologiske replikater per eksperiment. Hver mRNA ble fortynnet til 2,5 µ I OptiMEM (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) og tilsvarende passende volum av mRNA – In ble fortynnet I OptiMEM per brønn og protokollen ble fulgt i henhold til produsentens anbefaling. Fortynnet mRNA ble blandet med fortynnet lipid og tillatt å inkubere i 15 minutter ved romtemperatur før tilsetning til celler. Etter tilsetning av mRNA-lipidblanding til pasientfibroblaster ble cellene returnert til inkubator ved 37°C med 5% CO2. Etter 24 timer ble cellene forsiktig vasket med PBS to ganger og lysert i frisk RIPA buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) MED 1x proteasehemmere (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Cellelyse og total proteinkvantifisering: pasientfibroblastcellelysatene ble samlet i 0,5 mL rør (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) og sentrifugert ved 18000 x g ved 4°C for å fjerne celleavfall. Etter sentrifugering ble klar supernatant forsiktig overført til et separat merket rør og plassert på is. Total proteinkonsentrasjon ble bestemt MED bca-analysesett (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) i duplikat i 96-brønnformat i henhold til produsentens protokoll.

Wes Automatisert Kapillær Elektroforese FOR SERPINA1 Uttrykk. De endelige prøvene på 5 µ hver ved 0,4 mg/mL proteinkonsentrasjon ble utarbeidet i henhold Til Produsentens Instruksjoner For Protein Enkle Wes. Lysater ble analysert Ved Hjelp Av Protein Enkle wes størrelse-basert kapillær elektroforese system (ProteinSimple Wes; ProteinSimple, San Jose, CA). De størrelseseparerte proteinene ble undersøkt med antistoffer spesifikke FOR SERPINA1 ved 1:125 fortynning (Novus NBP1-90309, Novus Biologics, Littleton, CO) og husholdersken Tioredoksin ved 1:1000 (CST 2429, Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), visualisert ved hjelp av merkede kanin sekundære antistoffer og kvantitert ved hjelp av produsentens programvare. For hvert kjørefelt ble OMRÅDET under KURVEN (AUC) FOR SERPINA1 normalisert TIL AUC for tioredoksinkontrollen.

2.2. Alfa-1 Antitrypsinmangel Hepatocytter

Cellekultur Forhold. Aatd pasient-avledede hepatocytter ble generert fra aatd fibroblaster per DefiniGen (Cambridge UK) ved hjelp av en proprietær differensieringsprotokoll. Celler ble dyrket I DTM media OG DRM media (DefiniGen, Cambridge UK) og belagt på 500.000 celler per brønn i en 24-brønnplate. Celler ble dyrket i hypoksiske forhold på 37°C i 5% CO2 og 5% O2 med media blir endret annenhver dag i 10 dager før transfeksjon basert på proprietær produsentens protokoll(DefiniGen, Cambridge UK). Celler ble dyrket i hypoksiske forhold per produsentens instruksjoner, noe som muliggjorde cellevekst, mens ikke-toksiske forhold reduserte cellevekst.

Transfeksjonsbetingelser Og Proteinuttrykk av ELISA. Aatd Hepatocytter ble transfisert med 4ul Lipofectamine® 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) per 2.5ug mRNA, i 3 uavhengige eksperimenter med 3 biologiske replikater per eksperiment. Cellene ble deretter inkubert i 24, 48 og 72 timer før cellekulturmediene ble fjernet og analysert For SerpinA1 proteinkonsentrasjon ved HJELP AV EN ELISA Fra Abcam (Cambridge, MA) og etter produsentens protokoll.

2.3. In Vivo Studier

alle eksperimenter, husdyrhold, håndtering og eksperimentelle prosedyrer/protokoller ble godkjent og utført i samsvar Med Alexion Pharmaceuticals Inc. Iacuc retningslinjer og forskrifter. C57BL / 6 hannmus (6 uker gamle) ble brukt i denne studien. Mus ble holdt i et temperaturkontrollert miljø med en 12-h/12-h lys – mørk syklus, med en standard diett og vann ad libitum.

Formulering av mRNA i Lipid Nanopartikler Og In Vivo Dosering. mRNA-konstruksjoner ble formulert ved hjelp av en selvmonterende ioniserbar lipid nanopartikkel (LNP) som inneholder SERPINA1 mRNA. EN GFP koding mRNA ble brukt som en mRNA-lastet kjøretøy kontroll og PBS ble brukt som en negativ kontroll i dette eksperimentet. LNPs ble fremstilt ved rask blanding av mRNA i acetatbuffer ved pH 4.0 med en lipidblanding, Hepato9 mRNA kit (Precision NanoSystems), suspendert i etanol ved et lipid-til-stoff-forhold på ~11 (wt / wt). Dyr ble injisert med en enkelt intravenøs dose på 1,5 mg/kg formulert mRNA gjennom halevenen. Dyr ble ofret 24 timer etter injeksjon og vev ble fikset og behandlet for in situ hybridisering (ISH) og immunhistokjemi (IHC).

Prøveinnsamling og Ffpe Prøvepreparering. Dyr ble nekropsert, og den venstre laterale lobe ble plassert flatt i vevskassetter (Fisher Scientific). Kassetter ble deretter plassert i en beholder fylt med 10% Nøytral Bufret Formalin, NBF (Sigma) fiksativ løsning på minimum 1:20 forhold av vev volum versus fiksativ løsning. Prøver fikk lov til å fikse i minst 24h, men ikke mer enn 48h ved romtemperatur. Etter vevsfiksering ble kassetten plassert i en beholder fylt MED PBS i ikke mer enn 3 dager. ETTER pbs-vask ble levervev behandlet og innebygd i paraffinblokker.

2.4. Immunhistokjemi og In Situ Hybridiseringsprosedyrer

Immunhistokjemi for SERPINA1 ble utført på formalin-faste parafin-embedded, 5 µ vevsseksjoner ved bruk av et antistoff mot SERPINA1 (Atlas, HPA001292 ved 1: 100). Immunisering ble utført På Leica BOND rx-plattformen (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc. Buffalo Grove, IL) i henhold til standardprotokoller med passende positive kontroller. Antigen henting, standard På Leica BOND rx plattformen, benyttet leica ER1, EDTA-Tris, pH 8.0 løsning. Lysbilder ble dehydrert i en gradert etanolserie, ryddet i xylen og montert ved Bruk Av Cytoseal. Lysbilder ble avbildet ved HJELP AV VS120-systemet ved 40x forstørrelse (Olympus).

for mrna visualisering, in situ hybridisering (ISH) ble gjort. Custom RNA in situ hybridisering probe (Affymetrix, Santa Clara, CA) ble designet for å oppdage SERPINA1 mRNA. Automatisert RNA ISH-analyse ble utført med ViewRNA Ez-L Deteksjonssett (Affymetrix, Santa Clara, CA) og Leica BOND RX-plattformen (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) ble brukt. Formalin-fast, parafin-embedded (FFPE) vev ble fremstilt ved 5 um tykkelse på glassglass og satt På Leica BOND RX. ViewRNA ez-L-analysen ble kjørt i henhold til manufactures-protokollen, men kort sagt ble RNA avslørt med en 10-min inkubasjon ved 95°c i Bond Epitope Retrieval Solution 1 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL), etterfulgt av 20-min inkubasjon Med Proteinase K fra Bond Enzyme Forbehandlingssettet ved 1:1000 fortynning (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Hybridisering ble utført MED serpina1 1:40 probe fortynning etterfulgt Av FastRed deteksjon. For å sikre rna integritet og analyse prosedyre, ytterligere seksjoner ble også hybridisert med en sonde for peptidyl prolyl isomerase B (PPIB), en endogen housekeeping protein brukt som en positiv kontroll FOR ISH. For å kontrollere for ikke-spesifikk farging ble kontrollprobe mot bakteriell proteindihydrodipikolinatreduktase (dapB) brukt som negativ kontroll. Alle sonder var på en 1: 40 fortynning. Lysbilder ble lufttørket, ryddet i xylen, og montert Ved Hjelp Av Cytoseal. Lysbilder ble avbildet ved HJELP AV VS120-systemet ved 40x forstørrelse (Olympus).

3. Resultater

3.1. mRNA-Avledet Humant SerpinA1 Ekspresjon i Cellelysater og Cellemedier Av Pasientfibroblaster og Pasientfibroblast-Avledede Primære Hepatocytter

Human SERPINA1 mRNA fra TriLink ble transfisert til aatd pasientfibroblaster, oppnådd Fra Coriell Institute. Signifikant økning i humant SerpinA1 – proteinuttrykk ble observert i cellelysater (Figur 1 (a)) og cellekulturmedier (Figur 1(b)) ved transfeksjon av enten villtype (WT) eller FLAGGMERKET (FT) SerpinA1.

(a)
(a)
(b)
(b)

(a)
(a)(b)
(b)

Figure 1
In vitro human SerpinA1 expression in cell lysates (a) and cell media (b) from AATD patient fibroblasts and normal skin fibroblasts. Vehicle control is GFP mRNA; WT-SERPINA1 is WT mRNA sequence; FT-SerpinA1 is flag-tagged mRNA sequence.

HUMAN SERPINA1 mRNA-transfeksjon ble også utført i pasientfibroblast-avledede primære hepatocytter oppnådd Fra DefiniGen. Sekresjon AV WT serpina1 protein i kulturmediet ble økt ved 24h sammenlignet med kjøretøyet BARE gfp mRNA kontroll. Vi observerte en konsekvent økning i SerpinA1 proteinuttrykk over tid sett ved 48h og 72h etter transfeksjon (Figur 2).

Figure 2
In vitro human SerpinA1 expression in cell culture media obtained from patient fibroblast-derived hepatocytes (DefiniGen, Cambridge UK).

3.2. In Vivo Human SerpinA1 Expression in WT Mice

Human SerpinA1 protein expression was subsequently evaluated in WT C57bl/6 mice. Human SERPINA1 mRNA ble observert i leveren (Figur 3 (a)) som kan forventes gitt at mRNA er innkapslet i en lipid nanopartikkel som generelt leverer en stor del av sin last til leveren. Et spennende funn var AT SERPINA1 mRNA også ble oppdaget i lungene av mus (Figur 3(b)). SerpinA1 proteinuttrykk ble påvist ved bruk av et humant spesifikt SerpinA1 antistoff. SerpinA1-protein ble sett i både leveren (Figur 3 (c)) og lungene(Figur 3 (d)). Det sinusformede distribusjonsmønsteret Av SerpinA1 proteinuttrykk i leveren indikerer at SerpinA1 protein sannsynligvis blir utskilt i blodet av hepatocytter.

(streng)

(d)(d)

(a)
(a)(b)
(b)(redet)
(d)
(d)
in vivo menneskelig serpina1 mrna biddistribusjon i leveren (a) og lungene(b) av wt mippa 24h etter i.v. ble detoxedted motsatt ish. Røde prikker i bildet representerer mRNA. SerpinA1 protein ble visualisert i lever (c) og lunger (d) AV IHC.

4. Diskusjon

AATD er en ødeleggende sykdom med behov for effektive terapier til fordel for pasienter. Nåværende forsterkningsbehandling er utilstrekkelig for å unngå langvarig skade på leveren hos AATD-pasienter. For tiden forfølger mange grupper nye modaliteter for å gi mye trengte terapier som genterapi. For eksempel har benmarg-avledet stamcelletransplantasjon blitt testet I aatd-mus og vist noe redning av hepatocyttforringelse . Genutskiftningsstrategier blir også testet i klinikken, hvor ET WT serpina1-gen settes inn i leveren og uttrykker det riktige serpina1-proteinet. Nåværende metoder må fortsatt optimaliseres, OG AAV-mediert genlevering kan forårsake antistoffmediert reduksjon i proteinsekresjon eller en immunologisk reaksjon på viral kapsid.Vi evaluerte effekten av forbigående ekspresjon AV SERPINA1 mRNA i muselever da mRNA-levering til leveren er relativt grei og etablert via lipid nanopartikler (LNP), og vi kan administrere LNP-innkapslet mRNA uten signifikante immunreaksjoner. Først testet vi vår hypotese i aatd-pasientfibroblaster og pasientfibroblast-avledede primære hepatocytter. Våre data viser tydelig at VI kan kode SERPINA1 med mRNA og deretter uttrykke SerpinA1 protein fra begge celletyper. Vi viser også At SerpinA1-protein utskilles fra disse cellene, og proteinnivåene kan måles i supernatanten/cellekulturmediet. Dette innebærer at det mRNA-kodede SerpinA1-proteinet foldes og modifiseres hensiktsmessig i cellen for å muliggjøre sekresjon ut AV ER og inn i cellekulturmediet som er et sentralt trekk ved denne mRNA-terapien. Ved hjelp av mRNA-terapi kan vi bruke kroppens egne celler som en fabrikk for å syntetisere protein, posttranslationally modifisere det, og til slutt skille det ut i blodstrømmen. Foreløpig analyse av cellekulturmedium indikerer at det utskilte SerpinA1 er enzymatisk aktivt i en nøytrofil elastasehemmingsanalyse (data ikke vist). Våre data I Figur 1, 2 og 3 tyder på at nivåene Av SerpinA1 protein er betydelig høyere enn baseline eller negative kontrollnivåer. Disse nivåene bør være tilstrekkelige til å redusere nøytrofil elastaseaktivitet i plasma og lungene og dermed forhindre alveolær nedbrytning og emfysem, som er karakteristisk for AATD.Vi utvidet våre studier for å avgjøre om mRNA-kodet SERPINA1 kunne uttrykkes in vivo. Våre studier viser at intravenøst injisert humant SERPINA1 mRNA nådde både lever og lunger I WT-mus(Figur 3(a) og 3 (b)). Dermed kan lipidinnkapslet mRNA-behandling potensielt målrette begge steder AV aatd (lever og lunge). Enda viktigere, humant SerpinA1-protein ble produsert i både leveren og lungene AV WT-mus (Figur 3(c) og 3(d)). SerpinA1 – proteinuttrykksmønsteret i leveren sinusoider indikerer at proteiner blir utskilt av hepatocytter eller en annen levercelletype som stellatceller som normalt uttrykker SERPINA1. Våre data kan ikke utelukke muligheten for at mRNA kommer inn eller uttrykkes av andre leverceller i tillegg til hepatocytter, og dette vil trenge videre arbeid. Det er mulig at humant SerpinA1-protein i lungene kan komme fra to kilder: SERPINA1 mRNA som nådde lungene via iv-injeksjon, samt den utskilte humane SerpinA1 produsert av human serpina1 mRNA i leveren. I begge tilfeller er potensialet for SerpinA1-proteinuttrykk og lokalisering i lungene og leveren lovende, da det kan blokkere nøytrofil elastasemediert skade i lungene mens muligens redusere PIZZ-former i leveren. Den sistnevnte hypotesen er basert På studier Fra Karadagi et al. i dette tilfellet viste en økning I SerpinA1-protein ved forstørrelsesbehandling en reduksjon I PIZZ-formen i aatd-PASIENT PBMC. Dette øker muligheten for at mRNA-kodet SerpinA1-protein, når det uttrykkes i leveren, kan redusere hepatisk produksjon av PIZZ-formen og deretter hemme hepatisk fibrose. Hemming av leverfibrose og ER-stress kan til slutt redusere / eliminere AATD-pasientens behov for levertransplantasjon. Vår hypotese må testes in vivo i EN aatd-modell som demonstrerer leverfibrose og progresjon til hepatocellulært karsinom.Mens disse er spennende data, vil vi påpeke at mRNA-terapier må forbedres for å potensielt gi kronisk fordel for aatd-pasienter. Nåværende halveringstider for eksogent levert mRNA er typisk 24-48h i vev, mens proteinhalveringstider varierer avhengig av proteinet og dets nedbrytende mekanismer. Strategier for å øke halveringstiden til mrna er for tiden under utredning og tidlige data indikerer at vi kan øke varigheten av mrna stabilitet ved å modulere UTRs flankerer kodon-optimalisert mRNA . Rasjonelle protein engineering strategier er også rettet mot å lette økt protein halveringstid som resulterer i økt enzymatisk aktivitet og til slutt et redusert behov for dosering av mRNA terapi . Disse nye forbedringene kan resultere i en mRNA-behandling som doseres sjelden og opprettholder tilstrekkelig enzymaktivitet, f. eks. Av SerpinA1-protein, for å gi klinisk forbedring. Et annet aspekt som vil forbedre mRNA-terapier er sikkerheten VED lnp-levering, hvor vi kan dosere LNPs noen få uker. Dagens LNP-teknologi muliggjør et doseringsregime en gang i måneden, men støtter ikke en hyppigere dosering hvis vi kombinerer dosering med effekt. SOM nevnt tidligere KAN LNP-innkapslede mRNA-terapier redoseres, i motsetning til NOEN AAV-genterapier, og dosen kan titreres for å gi maksimal pasientfordel.

5. Konklusjon

våre studier presenterer potensialet for en ny terapeutisk modalitet, mRNA-terapi, hvorved et manglende eller ikke-funksjonelt protein kan erstattes for å utføre normale funksjoner. Våre funn viser at lipidinnkapslet mRNA kan målrettes mot lunge og lever som er de to primære sykdomsstedene I AATD. Mens tidligere studier som undersøkte mRNA-terapi for AATD har vist proteinuttrykk ved 24h I a549-og HEK293-celler, viser våre studier SerpinA1 – proteinuttrykk i aatd-pasientfibroblaster og pasientavledede hepatocytter som er relevante cellelinjer for sykdommen. I tillegg utvider vi tidligere studier på dette feltet ved å demonstrere at lipidinnkapslet mRNA kan levere til muselever og lunge og produsere SerpinA1-protein for å være funksjonelt relevant for pasienter. Videre forskning må utføres i en aatd sykdomsmodell og for å sikre sikkerheten ved gjentatt dosering av mRNA hos gnagere og høyere dyr før man vurderer denne modaliteten for human bruk. Samlet sett øker våre studier den interessante muligheten for at mRNA-terapi som bruker serpina1 mRNA, kan være gunstig for aatd-pasienter.

Datatilgjengelighet

alle data som støtter resultatene publisert i denne artikkelen er presentert i artikkelen. Det finnes ingen andre data tilgjengelig.

Interessekonflikter

alle forfattere er ansatte og aksjonærer I Alexion Pharmaceuticals, Inc., et selskap som utvikler terapier for sjeldne og ultrarare sykdommer.

Forfatternes Bidrag

Brendan Connolly designet og gjennomførte cellekultur, transfeksjoner og in vivo prøvebehandling. Cleo Isaacs designet OG utførte IHC. Lei Cheng designet OG utførte ISH-eksperimenter, manuskriptskriving og in vivo-studier. Kirtika H. Asrani utførte western blots, immunoassays og in vivo prøvebehandling. Romesh R. Subramanian designet eksperimenter, anmeldt data, og forfattet manuskript

Takk

Alexion Pharmaceuticals, Inc. er anerkjent for finansiering.

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.