Articles

middelen

Inleiding

Immunoassay is een biochemische methode die onbekende analyten (eiwitten, lipiden, nucleïnezuur enz.) identificeert en kwantificeert.) in oplossing (serum, urine enz.) met behulp van antilichaam-antigeen reacties. Er zijn vele verschillende formaten en variaties van een immunoassay, maar het belangrijkste punt is nog specifieke antilichaam-antigeen erkenning. Wat is een antigeen en een antilichaam? Waarom kan een antilichaam zich binden aan een antigeen?

een antigeen is een molecuul dat wordt herkend door het immuunsysteem, met name door antilichamen. Eiwitten, polysacchariden, pesticiden, antibiotica, toxines en hormonen kunnen allemaal antigenen zijn. Maar niet alle antigenen kunnen het immuunsysteem stimuleren om antilichamen aan te maken. Een antigeen dat een immune reactie kan opwekken, en in het bijzonder de synthese van antilichamen wordt genoemd een immunogeen. Proteã nen met molecuulgewichten hoger dan 5-10 kDa zijn immunogenen, terwijl kleine peptiden, pesticiden, antibiotica, of hormonen niet zijn. Deze stoffen met een laag moleculair gewicht worden haptens genoemd en moeten chemisch worden gekoppeld aan Grotere dragermoleculen, zoals runderserumalbumine of keyhole Limpet hemocyanine, om specifieke antilichaamvorming op te wekken.

een antilichaam is een Y-vormig groot eiwit (160 kDa) dat twee gecombineerde plaatsen (paratopen) bevat die specifiek binden aan een beperkt oppervlak (epitoop) van het antigeen. Epitopes worden meestal gevestigd op het hydrofiele deel van het antigeen, en hun grootte is 10-15 aminozuurresidu ‘ s die op de eiwitketen (lineaire epitope) of discontinue nog ruimtelijk dicht op de eiwitketen kunnen zijn.

de antilichaam-antigeenreactie is een typische reversibele bimoleculaire reactie met snelheidsconstanten voor de voorwaartse en achterwaartse reacties die afhankelijk zijn van de concentratie van het antigeen (Ag) en het antilichaam (Ab), affiniteit voor het antigeen zoals gedefinieerd door de associatieconstante van het antilichaam voor zijn antigeen, temperatuur, pH en andere omgevingsomstandigheden. Immunoassays zijn gebaseerd op de band en complex van een antigeen aan een antilichaam en de mensen gebruiken één of andere fysische of chemische middelen om het complexe antigeen-antilichaam te meten en te kwantificeren.

antigeen en antilichaam

figuur 1. Antigeen en antilichaam. (A) De kleine molecules kunnen door antilichaam worden herkend maar kunnen het immuunsysteem niet stimuleren om antilichaam te produceren. Ze moeten combineren met adjuvantia (meestal eiwitten) om een immunogeen te vormen. Eiwitten kunnen altijd een immunogeen zijn. (b) het antilichaam kan structurele specifieke gebieden op antigeen erkennen, dat epitope wordt genoemd. De gebieden van de erkenning op het antilichaam worden genoemd paratopen. (c)een antilichaam is een Y-vormige moleculaire. d) een antilichaam bestaat uit twee zware en twee lichte ketens verbonden door disulfidebindingen. De Fab-fragmenten van H-en L-ketens zijn sterk variabel en de Fc-fragmenten zijn conservatief.

Immunoprecipitatie

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld voor het visualiseren van de primaire Ag-Ab-reactie. Precipitatie van grote cross-linked AG-Ab complexen kan zichtbaar zijn voor de blote ogen zonder het gebruik van geëtiketteerde reagentia voor versterking.

de precipitatiereactie is een zeer specifieke serologische reactie waarbij antigeen door antilichamen wordt gebonden. Elk antilichaam heeft twee plaatsen van de antigeenband en elk antigeen heeft veelvoudige antigene epitopen. Wanneer de oplosbare antigenen door antilichaam worden gebonden om een cross-linked “rooster” structuur te vormen, wordt de reactie genoemd precipitatie. De precipitatiereactie wordt geremd wanneer of antigeen of antilichaam in grote overmaat aanwezig is. Het bereik van optimale concentraties waarbij de grootste hoeveelheid neerslag wordt gegenereerd wordt de equivalente zone genoemd. Gebaseerd op dit principe, kan de aanwezigheid van specifieke antigenen in een mengsel en de relatieve concentratie van antigenen worden ontdekt door antilichamen te gebruiken.

Immunodiffusiemechanisme

Figuur 2. Immunodiffusie mechanisme. (a) de hoeveelheid precipitatie wordt beïnvloed door de concentratie van antilichaam en antigeen. B) schema van radiale immunodiffusie. C) schema van dubbele immunodiffusie.

twee soorten precipitatiereacties kunnen worden gebruikt om relatieve concentraties van antilichamen of antigenen te bepalen. Het zijn radiale immunodiffusie (de Mancini-methode) en dubbele immunodiffusie (de Ouchterlony-methode). Beide worden uitgevoerd in een halfvaste medium zoals agar. In radiale immunodiffusie, wordt een antigeensteekproef in een put geplaatst en toegestaan om in agar te verspreiden die een geschikte verdunning van een antiserum bevatten. Aangezien het antigeen in agar verspreidt, wordt het gebied van gelijkwaardigheid gevestigd en een ring van precipitatie evenals een precipitinring, vorm rond de put (figuur 2b). Het gebied van de precipitinring is evenredig aan de concentratie van antigeen. Door het gebied van de precipitinring met een standaardkromme te vergelijken (verkregen door de precipitingebieden van bekende concentraties van het antigeen te meten), kan de concentratie van de antigeensteekproef worden bepaald. Bij de Ouchterlony-methode diffunderen zowel antigeen als antilichaam radiaal vanuit putten naar elkaar, waardoor een concentratiegradiënt ontstaat. Als equivalentie wordt bereikt, vormt zich een zichtbare neerslaglijn (figuur 2c).

hoewel nuttig, zijn immunodiffusie en immuno-elektroforese vervelend en tijdrovend, moeilijk te automatiseren en niet gemakkelijk toe te passen op massasteekproeven.

gelabelde Immunoassay

Immunoassays maken gebruik van een verscheidenheid aan verschillende labels om de detectie van antilichamen en antigenen mogelijk te maken. De etiketten zijn typisch chemisch-verbonden of geconjugeerd aan het gewenste antilichaam of antigeen.

afhankelijk van het verschil tussen label-en signaaldetectiestrategie kan immunoassay worden geclassificeerd als de volgende typen:

1. Radioimmunoassay (RIA)

RIA is een immunoassay die radioactieve isotopen (bv. i-235) gebruikt om het antilichaam/antigeen te labelen. Het detecteert de radioactiviteit om de antilichaam-antigeensamenstelling met zeer hoge gevoeligheid te meten. RIA waren enkele van de vroegste immunoassays ontwikkeld, en viel uit de gunst grotendeels toe te schrijven aan de moeilijkheid en potentiële gevaren die door het werken met radioactiviteit worden voorgesteld.

2. Enzyme Immunoassay (EIA)

EIA is mogelijk een van de meest populaire gebruikte immunoassays. In plaats van radioactieve isotopen gebruiken EIA enzymen (bijvoorbeeld HRP, AP) als sondes. Deze enzymen staan detectie vaak toe omdat zij een waarneembare kleurverandering veroorzaken in de aanwezigheid van bepaalde reagentia van substraat en chromogeen (B.V. DAB, TMB) op basis van de enzymatische reacties.

meer informatie over ELISA Kit ontwikkeling

3. Fluoroimmunoassay (FIA)

FIA is analoog aan RIA, behalve dat het label een fluorofoor (bijvoorbeeld FITC, phycoerythrin) is in plaats van een radio-isotoop. Het fluorescentiesignaal kan direct worden gemeten door instrument te ontdekken.

4. Chemiluminescentie-Immunoassay (CLIA)

CLIA is een methode om de concentratie van monsters te bepalen op basis van de intensiteit van de luminescentie die de chemische reactie uitzendt. CLIA combineert de CL systemen en de immunoreacties. Sommige reagentia zijn gebruikt als cl-etiketten. Bij de introductie van de CL-substraten produceert het systeem chemiluminescentie. Zo kunnen de steekproeven kwantitatief worden ontdekt. De meest populaire CL-substraten zijn luminol, isoluminol en hun derivaten, acridinium – esterderivaat, peroxidase en alkalische fosfatase (ALP).

5. Immunochromatograohic Assay (ICA)

ICA ook bekend als laterale flow immunoassay is een snelle test immunoassay om de aanwezigheid (of afwezigheid) van een target analyt in Monster (matrix) te detecteren zonder de noodzaak van gespecialiseerde en dure apparatuur. In dit soort analyse, worden de vangstantilichamen geà mmobiliseerd als dwarslijn op poreuze hydrofiele materialen. Analytes in buffer worden dan toegevoegd aan één kant van de teststrook, gedreven door de laterale capillaire kracht. De analytes stroom door over de lijn van het vangstantilichaam en gevangen door antilichaam. Aangezien de gevangen analytes zich accumuleerden, kon het complex door de nanoparticleetiketten (gewoonlijk colloïdaal goud) worden geopenbaard en direct door blote ogen worden bekeken.

vergelijking van de vijf verschillende geëtiketteerde immunoassays hierboven is weergegeven in de volgende tabel. Elke methode heeft zijn eigen voor-en nadelen, zodat we flexibel de meest geschikte middelen konden kiezen om onze test te optimaliseren.

Illustration Label Substrates Signal Sensitivity Advantages Drawbacks
Radioimmunoassay
(RIA)
Radioimmunoassay Radioactive
Isotopes
(I-125)
None Radiation Ultrahigh 1. Sensitive and precise
2. Radio-label conjugation easy to prepare
1. Radio-isotopen moeten binnen enkele weken worden gebruikt
2. Risico van blootstelling aan straling
Enzyme Immunoassay
(EIA)
Enzyme Immunoassay enzymen
(HRP,AP)
chromogeen/ substraat kleurverandering hoog 1. Gevoelig en veilig
2. Snel en handig, eenvoudig te automatiseren
3. Op grote schaal gebruikt in verschillende testen
1.
monoklonaal antilichaam nodig hebben 2. Niet – specifieke absorptie
3. Enzym / substraat reactie is op korte termijn en moet snel worden gelezen.
Fluoroimmunoassay
(FIA)
Fluorenscence Immunoassay Fluorogenic
Reporters
(Rhodamine)
None Fluorescence High 1. Sensitive, specific and save
2. Limited background fluorescence
3. Easy to automation
4. multiple label can be used
1. Rely on fluorescence detecting instrument
2. Photo bleaching
Chemiluminescence
Immunoassay
(CLIA)
Chemiluminescence Immunoassay Chemical
probes
(Acridinium Ester, luminol)
luminescence substrate Visible light Ultrahigh 1. Excellent sensitivity and safe
2. Stable of reagent
3. Eenvoudig automatisering, kan gebruikt worden in high-throughput-systeem
Moet CCD-apparatuur voor het vastleggen van de licht-signaal
Colloïdaal Goud
Immunochromatographic
Gehalte
(ICA)
Colloïdaal Goud Immunochromatorgraphic Gehalte Colloïdaal goud
nanodeeltje
Geen Zichtbare kleur Laag 1. Snel, gebruiksvriendelijk
2. Lage kosten en veilig
3. Zichtbaar, zonder apparatuur
lage gevoeligheid en specificiteit

6. Immunohistochemie (IHC)

IHC combineert histologische, immunologische en biochemische technieken voor de identificatie van specifieke weefselcomponenten door middel van een specifieke antigeen/antilichaamreactie met een zichtbaar etiket. IHC maakt het mogelijk om de distributie en lokalisatie van specifieke cellulaire componenten binnen een cel of weefsel te visualiseren. Het populairste type van IHC is chromogene en fluorescentieopsporing die door een enzym of fluorophore wordt bemiddeld, respectievelijk, welk basisprincipe aan EIA en FIA gelijk is.

Etiketvrije Immunoassay

hoewel een soort etiket over het algemeen wordt gebruikt in immunoassays, zijn er bepaalde soorten tests die niet afhankelijk zijn van etiketten. In plaats daarvan, gebruik opsporingsmethoden die niet de wijziging vereisen of het etiketteren van de componenten van de analyse. Surface plasma resonance (SPR) en quartz crystal microbalance (QCM) zijn twee typische labelvrije methoden.

oppervlakteplasmaresonantie is de resonante oscillatie van geleidingselektronen op het raakvlak tussen een negatief en positief permittiviteitsmateriaal dat wordt gestimuleerd door invallend licht. Het is hoofdzakelijk de massa van analyte die aan de substraatfilm van de sensorspaander wordt gebonden die de index van breking verandert die op diverse manieren kan worden gemeten. Geen geëtiketteerde reporter molecuul is nodig. Omdat de veranderingen in SPR snel optreden en in realtime kunnen worden gecontroleerd, kan de bindingsreactie kinetiek worden bestudeerd.

microbalans van kwartskristallen op basis van het omgekeerde piëzo-elektrisch effect. De massa-afzetting op het elektrodeoppervlak is evenredig met de resonantiefrequentie van het substraatkristal. Als wij vangen antilichaam op de elektrodeoppervlakte van QCM-spaander immobiliseren en stroom analyte, zou het bindende proces van antilichaam en analyte door de opsporing van frequentieverandering zonder enig etiket van antilichaam of antigeen kunnen worden gemeten.

Darwish I A. Immunoassay methods and their applications in pharmaceutical analysis: basic methodology and recent Advanced. Int J Biomed Sci, 2006, 2: 217-235.
Levieux D. 11 Immunodiagnostic Technology and Its Applications. Vooruitgang in Voedseldiagnostiek, 2008: 211.
Brandon D L, Carter J M. Immunoassay. Handbook of Food Safety Engineering, 2012: 279-312.
Ricchiuti V. op IMMUNOASSAY gebaseerde technieken voor het meten van biologische materialen die worden gebruikt voor BIOMERKERSONTDEKKING en translationeel onderzoek. Biomarkers: in geneeskunde, drugontdekking, en milieugezondheid, 2010: 425.
Proll G, Ehni M. Immunoassays. Handbook of Spectroscopy: Second, Enlarged Edition, 2014: 1313-1334.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.