Articles

SERPINA1 mRNA als behandeling voor Alfa-1-antitrypsinedeficiëntie

Abstract

alfa-1-antitrypsine (AAT) – deficiëntie is een genetische aandoening die inactieve / defecte AAT veroorzaakt door mutaties in het SERPINA1-gen dat AAT codeert. Deze ziekte wordt geassocieerd met verminderde activiteit van AAT in de longen en afzetting van overmatig defecte AAT-eiwit in de lever. Momenteel is er geen specifieke behandeling voor leverziekte geassocieerd met AAT deficiëntie. AAT longziekte wordt vaak behandeld met een van de verschillende serum eiwitvervangende producten; langetermijnstudies naar de werkzaamheid van SerpinA1-vervangingstherapie zijn echter niet beschikbaar en het vermindert de leverschade bij AAT-deficiëntie niet. mRNA therapie kan mogelijk gericht zijn op zowel de lever als de longen van AAT deficiënte patiënten. De geduldige fibroblasten van AAT en de geduldige fibroblast-afgeleide hepatocyten van Aat werden getransfecteerd met SERPINA1-coderend mRNA en de media van de celkweek werden getest voor SerpinA1 uitdrukking. Onze gegevens tonen verhoogde SerpinA1 eiwit in cultuurmedia van behandelde AAT patiënt fibroblasten en Aat patiënt fibroblast-afgeleide hepatocyten. In vivo studies bij wild type muizen tonen SERPINA1 mRNA biodistributie in lever en longen, evenals SerpinA1 eiwitexpressie in deze twee doelorganen die kritisch worden beïnvloed bij AAT deficiëntie. Al met al, onze gegevens suggereren dat SerpinA1 mRNA therapie heeft het potentieel om te profiteren van patiënten die lijden aan AAT deficiëntie.

1.

alfa-1-antitrypsinedeficiëntie (AATD) is een verwoestende ziekte met een gebrek aan adequate therapieën. De huidige therapieën beschermen alleen de longen en vereisen in gevorderde gevallen frequente intraveneuze injecties van plasma-afgeleid AAT-eiwit. Patiënten met AATD zijn gepredisponeerd voor obstructieve longziekte en leverziekte (bijv., cirrose en hepatocellulair carcinoom bij kinderen en volwassenen) . Ongeveer 1-5% van de patiënten met gediagnosticeerde chronische obstructieve longziekte (COPD) wordt geschat om alfa-1-antitrypsinedeficiëntie te hebben . Hoewel zeer zeldzaam, emfyseem bij kinderen met AATD is gemeld en de incidentie van leverziekte toeneemt met de leeftijd . Ernstige symptomen treden op latere leeftijd op, met name bij rokers. Leversymptomen van AATD worden laat in het leven gezien en vereisen vaak levertransplantatie. AATD is een erfelijke ziekte veroorzaakt door mutaties in het SERPINA1 gen . Het SERPINA1 gen heeft twee allelen aangeduid als M allelen (normale patiënten hebben een MM genotype). Het meest voorkomende allel dat resulteert in ernstige AAT-deficiëntie wordt z (E342K) genoemd . Er is gemeld dat 95% van de ernstige AATD-patiënten een genotype van ZZ heeft en slechts 10-20% van SerpinA1-serumspiegels heeft . In gevallen van ZZ-mutatie kan het SerpinA1-eiwit niet goed vouwen en zal het niet worden afgescheiden door hepatocyten; daarom wordt AATD niet veroorzaakt door een onvermogen om eiwitten te maken, maar een onvermogen om functionele eiwitten af te scheiden. De accumulatie van ZZ SerpinA1 in hepatocyten resulteert in ernstige leverschade . Homozygote PIZZ is vrij algemeen en komt voor in 1: 2500-3000 geboorten in Noord-Amerika en Europa.

alfa-1-antitrypsine (AAT), ook bekend als SERPINA1 (serine proteaseremmer, Groep A, lid 1), is een uitgescheiden eiwit dat voornamelijk wordt geproduceerd door hepatocyten en in mindere mate door mononucleaire fagocyten, neutrofielen en luchtweg/intestinale epitheliale cellen . SerpinA1 is een circulerend glycoproteïne dat ook in water oplosbaar is en weefsel diffuseerbaar is . De primaire rol van SerpinA1 is serine protease regulatie en de belangrijkste plaats van deze actie is in de longen. Daar bindt en inactiveert SerpinA1 neutrofielelastase en beschermt zo alveolaire weefsels tegen proteolytische afbraak tijdens ontstekingsreacties . SerpinA1 is de meest voorkomende circulerende anti-protease en normale plasmaconcentraties van SerpinA1 bereiken gewoonlijk 1-2g / L .

AATD wordt gekenmerkt door polymerisatie van verkeerd gevouwen SerpinA1-eiwitten in het ruwe endoplasmatische reticulum van hepatocyten, waardoor de concentratie en activiteit van SerpinA1 in bloed en weefsels afneemt . Bij patiënten met ernstige deficiëntie zijn SerpinA1-serumconcentraties lager dan 50 mg/dL, terwijl de normale waarden 200 mg/dL bedragen. Met lage niveaus van circulerende SerpinA1, zijn de longen niet beschermd tegen neutrofielelastase, een enzym dat alveoli vernietigt en longziekte veroorzaakt. Daarom zijn de meest voorkomende klinische complicaties van AATD longemfyseem en leverziekte .

tot op heden is alleen Aat-augmentatietherapie beschikbaar voor de behandeling van AATD. Aat-augmentatietherapie werd ontwikkeld in 1987 en is momenteel alleen goedgekeurd voor commercieel gebruik bij geselecteerde patiënten met ernstig aatd-gerelateerd longemfyseem . AAT-augmentatie helpt alleen om SerpinA1 aan de longen te leveren waar het kan helpen neutrofielelastase schade te voorkomen. Aangezien serumdeficiëntie niet de oorzaak van leverschade is, is er geen specifieke behandeling voor patiënten die lijden aan leverziekte geassocieerd met AATD. De enige behandeling is ondersteunende zorg voor typisch leverfalen en levertransplantatie voor patiënten met gedecompenseerde cirrose .

AATD is een monogene aandoening waardoor het een ideaal doelwit is voor mRNA-therapie. mRNA is een nieuwe modaliteit die potentieel voor een brede waaier van ziekten wegens zijn enorme flexibiliteit over traditionele biologische en enzymvervangingstherapeutics van toepassing is. mRNA-gebaseerde therapeutics gebruiken endogene machines van de gastheercel voor de productie en posttranslational wijziging van doelproteã nen, die voor de ontwikkeling van therapeutics voor ziekten niet eerder targetable toestaan. We voerden in vitro en in vivo studies uit om te bepalen of we exogeen gecodeerde SerpinA1 konden uitdrukken en het mRNA/eiwit konden richten op het juiste orgaan.

mRNA-therapie kan mogelijk gericht zijn op zowel de lever als de longen van patiënten met AAT-deficiëntie (in afwachting van lopende experimenten). Onze gegevens toonden verhoogde SerpinA1 eiwit in celkweekmedia van behandelde Aat patiënt fibroblasten, evenals in de celkweekmedia van AAT patiënt fibroblast-afgeleide primaire hepatocyten. Bovendien werden bij WT-dieren die SERPINA1 mRNA via intraveneuze injectie toegediend kregen, zowel SERPINA1 mRNA als SerpinA1-eiwit aangetroffen in zowel de lever als de longen. Samen, onze gegevens suggereren dat mRNA-gemedieerde expressie van SerpinA1 eiwit in de longen neutrofiel elastase zou kunnen remmen, terwijl het MM isovorm expressie in de lever zou kunnen bevorderen en bieden meerdere routes van voordeel voor AAT patiënten.

2. Materialen en methoden

2.1. AATD Patiëntenfibroblasten

celkweken. De volgende patiëntfibroblasten werden verkregen van het Coriell Institute for Medical Research, Cell Repository (Camden, NJ): GM11423 en GM12445 van aatd geduldige lever en GM02522 van AATD geduldige huid en de normale controle fibroblastlijn ND34769 van huid. Cellen werden gekweekt in Eagle ‘S minimale essentiële Medium met Earle’ s zouten en niet-essentiële aminozuren (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) aangevuld met 15% foetaal runderserum en geïncubeerd bij 37°C in 5% CO2.

Transfectiecondities. Patiënt fibroblasten werden getransfecteerd met 2.5ug van elk mRNA en 4 µl van mRNA – in lipidetransfectiereagens (MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD), in 3 onafhankelijke experimenten met 3 biologische replicaten per experiment. Elk mRNA werd verdund tot 2,5 µg in OptiMEM (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) en een soortgelijke hoeveelheid mRNA-In werd verdund in OptiMEM per putje en het protocol werd gevolgd overeenkomstig de aanbeveling van de fabrikant. Verdund mRNA werd gemengd met verdund lipide en liet 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur alvorens aan cellen toe te voegen. Na toevoeging van mRNA-lipidenmengsel aan geduldige fibroblasten, werden de cellen aan incubator bij 37°C met 5% CO2 teruggegeven. Na 24 uur werden cellen voorzichtig gewassen met PBS tweemaal en gelyseerd in verse RIPA buffer (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) met 1x proteaseremmers (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

cellysis en totale eiwitkwantificatie: de fibroblastcellysaten van de patiënt werden verzameld in 0,5 mL tubes (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) en gecentrifugeerd bij 18000 x g bij 4°C om celresten te verwijderen. Na centrifugering werd het heldere supernatant voorzichtig overgebracht naar een aparte geëtiketteerde buis en op ijs geplaatst. De totale eiwitconcentratie werd bepaald met BCA assay kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) in duplicaat in 96-well formaat volgens het Protocol van de fabrikant.

Wes geautomatiseerde capillaire elektroforese voor SERPINA1 expressie. De uiteindelijke monsters van 5 µl elk bij 0,4 mg / mL eiwitconcentratie werden bereid volgens de instructies van de fabrikant van proteïne Simple Wes. De lysaten werden geanalyseerd gebruikend het eiwit eenvoudige Wes grootte-gebaseerd capillaire elektroforesesysteem (ProteinSimple Wes; ProteinSimple, San Jose, CA). De grootte-gescheiden eiwitten werden onderzocht met antilichamen specifiek voor SERPINA1 bij 1: 125 verdunning (Novus NBP1-90309, Novus Biologics, Littleton, CO) en de huishoudster Thioredoxine bij 1:1000 (CST 2429, Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), gevisualiseerd met behulp van geëtiketteerde konijn secundaire antilichamen en gekwantificeerd met behulp van de software van de fabrikant. Voor elke rijstrook werd de oppervlakte onder de curve (AUC) van de SERPINA1 genormaliseerd tot de AUC van de Thioredoxin-controle.

2.2. Alfa-1 antitrypsine deficiënte hepatocyten

Celcultuuromstandigheden. De patiënt-afgeleide hepatocytes van AATD werden geproduceerd van AATD fibroblasten door DefiniGen (Cambridge UK) gebruikend een eigen differentiatieprotocol. Cellen werden gekweekt in DTM media en DRM media (DefiniGen, Cambridge UK) en geplateerd op 500.000 cellen per put in een 24-well plaat. Cellen werden gekweekt in hypoxische omstandigheden bij 37°C in 5% CO2 en 5% O2 met de media worden elke twee dagen veranderd gedurende 10 dagen voorafgaand aan transfectie op basis van eigen fabrikant protocol (DefiniGen, Cambridge UK). De cellen werden gekweekt in hypoxic voorwaarden volgens de instructies van de fabrikant, die de celgroei toeliet, terwijl de niethypoxic Voorwaarden de celgroei verminderden.

Transfectieomstandigheden en eiwitexpressie door ELISA. De hepatocyten van AATD werden getransfecteerd met 4ul Lipofectamine ® 2000( Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) per 2.5UG mRNA, in 3 onafhankelijke experimenten met 3 biologische replicaten per experiment. Cellen werden vervolgens gedurende 24, 48 en 72 uur geïncubeerd voordat de celcultuurmedia werden verwijderd en geanalyseerd voor SerpinA1-eiwitconcentratie met behulp van een ELISA van Abcam (Cambridge, MA) en volgens het Protocol van de fabrikant.

2.3. In Vivo onderzoek

alle experimenten, dierenhuisvesting, hantering en experimentele procedures/protocollen werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met Alexion Pharmaceuticals Inc. Iacuc richtlijnen en voorschriften. In dit onderzoek werden c57bl / 6 mannelijke muizen (6 weken oud) gebruikt. Muizen werden gehouden in een temperatuur gecontroleerde omgeving met een 12-h/12-h licht-donker cyclus, met een standaard dieet en water ad libitum.

formulering van mRNA in lipide Nanodeeltjes en in Vivo dosering. mRNA constructen werden geformuleerd gebruikend een zelf-assemblerend ioniseerbaar lipide nanoparticle (LNP) die SERPINA1 mRNA bevatten. Een GFP die mRNA codeert werd gebruikt als mRNA-geladen voertuigcontrole en PBS werd gebruikt als negatieve controle in dit experiment. LNPs werden bereid door snelle menging van mRNA in acetaatbuffer bij pH 4.0 met een lipidenmix, Hepato9 mRNA-uitrusting (Precisienanosystems), opgeschort in ethanol bij een lipide-aan-drugverhouding van ~11 (wt/wt). De dieren werden geïnjecteerd met een enkele intraveneuze dosis van 1,5 mg/kg geformuleerd mRNA via de staartader. De dieren werden 24 uur na de injectie gedood en de weefsels werden gefixeerd en verwerkt voor in situ hybridisatie (ISH) en immunohistochemie (IHC).

monsterverzameling en monstervoorbereiding van het FFPE. Dieren werden necropsie, en de linker laterale kwab werd plat geplaatst in weefsel cassettes (Fisher Scientific). Vervolgens werden Cassettes in een container geplaatst die gevuld was met 10% neutrale gebufferde formaline, NBF (Sigma) fixatieve oplossing met een verhouding van minimaal 1:20 van het weefselvolume ten opzichte van de fixatieve oplossing. De monsters mochten gedurende ten minste 24 uur maar niet meer dan 48 uur bij kamertemperatuur worden gefixeerd. Na weefselfixatie werd de cassette niet langer dan 3 dagen in een container met PBS geplaatst. Na het wassen van PBS werden leverweefsels verwerkt en ingebed in paraffineblokken.

2.4. Immunohistochemie en in Situ Hybridisatieprocedures

immunohistochemie voor SERPINA1 werd uitgevoerd op met formaline gefixeerde paraffine ingebedde, 5 µm weefselsecties met behulp van een antilichaam tegen SERPINA1 (Atlas, HPA001292 bij 1:100). Immunostaining werd uitgevoerd op het Leica BOND RX-platform (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) volgens standaardprotocollen met passende positieve controles. Antigeen retrieval, standaard op het Leica BOND RX-platform, maakte gebruik van de Leica er1, EDTA-Tris, pH 8.0-oplossing. De dia ‘ s werden gedehydrateerd in een gegradeerde ethanolreeks, in xyleen geklaard, en gemonteerd gebruikend Cytoseal. Dia ‘ s werden afgebeeld met behulp van het VS120 systeem bij 40x vergroting (Olympus).

voor mRNA-visualisatie werd in situ hybridisatie (ISH) uitgevoerd. De in situ hybridisatiesonde van douanerna (Affymetrix, Santa Clara, CA) werd ontworpen om SERPINA1 mRNA te ontdekken. Geautomatiseerde RNA-ISH-test werd uitgevoerd met behulp van de ViewRNA EZ-L-Detectiekit (Affymetrix, Santa Clara, CA) en het Leica BOND RX-platform (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) werd gebruikt. Formaline-gefixeerde, paraffine-ingebed (FFPE) weefsels werden bereid op 5 um dikte op glasplaten en op de Leica BOND RX geplaatst. De ViewRNA eZ-L-test werd uitgevoerd volgens het fabricageprotocol, maar in het kort werd RNA ontmaskerd met een incubatietijd van 10 minuten bij 95°C in Bond-Epitope Retrievaloplossing 1 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL), gevolgd door een incubatietijd van 20 minuten met proteïnase K uit de Bond-Enzymvoorbehandelingskit bij 1:1000 verdunning (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Hybridisatie werd uitgevoerd met SERPINA1 1: 40 sondeverdunning gevolgd door FastRed detectie. Om de integriteit en de testprocedure van RNA te verzekeren, werden de extra secties ook gekruist met een sonde voor peptidyl prolyl isomerase B (PPIB), een endogene die huishoud proteã ne als positieve controle voor ISH wordt gebruikt. Om te controleren op niet-specifieke kleuring, controle probe tegen bacteriële eiwitdihydrodipicolinaat reductase (dapB) werd gebruikt als een negatieve controle. Alle sondes waren op een 1: 40 verdunning. De objectglaasjes werden aan de lucht gedroogd, geklaard in xyleen en gemonteerd met behulp van Cytoseal. Dia ‘ s werden afgebeeld met behulp van het VS120 systeem bij 40x vergroting (Olympus).

3. Resultaten

3.1. mRNA-afgeleide Humane SerpinA1-expressie in Cellysaten en Celmedia van Patiëntfibroblasten en Patiëntfibroblast-afgeleide primaire hepatocyten

humaan SERPINA1 mRNA van TriLink werd getransfecteerd in aatd-patiëntfibroblasten, verkregen van het Coriell Institute. In cellysaten (figuur 1(A)) en celcultuurmedia (figuur 1(b)) werd een significante toename van de menselijke serpina1-eiwitexpressie waargenomen na transfectie van ofwel wild type (WT) ofwel FLAG-tagged (FT) SerpinA1.

(a)
(a)
(b)
(b)

(a)
(a)(b)
(b)

Figure 1
In vitro human SerpinA1 expression in cell lysates (a) and cell media (b) from AATD patient fibroblasts and normal skin fibroblasts. Vehicle control is GFP mRNA; WT-SERPINA1 is WT mRNA sequence; FT-SerpinA1 is flag-tagged mRNA sequence.

Humane SERPINA1 mRNA-transfectie werd ook uitgevoerd in patiëntfibroblast-afgeleide primaire hepatocyten verkregen uit DefiniGen. De afscheiding van de proteã ne van WT SerpinA1 in het cultuurmedium werd verhoogd bij 24h in vergelijking met het voertuig slechts mRNA controle GFP. We merkten een consistente toename van SerpinA1 eiwitexpressie in de tijd zoals waargenomen bij 48h en 72h na transfectie (Figuur 2).

Figure 2
In vitro human SerpinA1 expression in cell culture media obtained from patient fibroblast-derived hepatocytes (DefiniGen, Cambridge UK).

3.2. In Vivo Human SerpinA1 Expression in WT Mice

Human SerpinA1 protein expression was subsequently evaluated in WT C57bl/6 mice. Menselijke SERPINA1 mRNA werd waargenomen in lever (Figuur 3 (A)) zoals kan worden verwacht gezien het feit dat mRNA wordt ingekapseld in een lipide nanoparticle die over het algemeen een grote hoeveelheid van zijn lading aan de lever levert. Een intrigerende bevinding was dat SERPINA1 mRNA ook werd gedetecteerd in de longen van muizen (Figuur 3(b)). SerpinA1 eiwituitdrukking werd ontdekt gebruikend een menselijk specifiek serpina1 antilichaam. SerpinA1 eiwit werd gezien in zowel de lever (Figuur 3 (c)) als in de longen (Figuur 3(d)). Het sinusoïdale distributiepatroon van SerpinA1 eiwitexpressie in de lever geeft aan dat SerpinA1 eiwit waarschijnlijk wordt afgescheiden in het bloed door hepatocyten.

b)

(c)(string)

div>

(d)(d)

a)
(a)b)
(b)(redet)
d)
(d)
in vivo menselijke serpina1 mrna biddistribution in de lever(a) en de longen(b) van wt mippa 24u na ik.v. was detoxedted tegenover ISH. De rode punten in het beeld vertegenwoordigen mRNA. SerpinA1 eiwit werd gevisualiseerd in lever (c) en longen (d) door IHC.

4. Discussie

AATD is een verwoestende ziekte met een behoefte aan efficiënte therapieën ten behoeve van patiënten. De huidige augmentatietherapie is ontoereikend om langdurige schade aan de lever van AATD-patiënten te voorkomen. Momenteel streven vele groepen nieuwe modaliteiten na om broodnodige therapieën zoals gentherapie te verstrekken. Bijvoorbeeld, is de transplantatie van de beendermerg-afgeleide stamcel getest in aatd muizen en wat redding van hepatocyte verslechtering aangetoond . De strategieën van de genvervanging worden ook getest in de kliniek , waarin een gen WT SERPINA1 in de lever wordt ingebracht en het aangewezen SerpinA1 eiwit uitdrukt. De huidige methodes moeten nog worden geoptimaliseerd en AAV-gemedieerde genlevering kan antilichaam-gemedieerde daling van eiwitafscheiding of een immunologische reactie op virale capside veroorzaken.

we evalueerden het effect van voorbijgaande expressie van SERPINA1 mRNA in muizenlever aangezien mRNA-toediening aan de lever relatief eenvoudig is en wordt vastgesteld via lipide nanodeeltjes (LNP), en we LNP-ingekapseld mRNA kunnen toedienen zonder significante immuunreacties. Aanvankelijk testten we onze hypothese in aatd patiënt fibroblasten en patiënt fibroblast-afgeleide primaire hepatocyten. Onze gegevens tonen duidelijk aan dat we SERPINA1 kunnen coderen met mRNA en vervolgens SerpinA1-eiwit van beide celtypen kunnen uitdrukken. We tonen ook aan dat SerpinA1 eiwit wordt afgescheiden van deze cellen en eiwitniveaus kunnen worden gemeten in het supernatant/celkweekmedium. Dit impliceert dat de mRNA-gecodeerde SerpinA1 proteã ne gepast binnen de cel wordt gevouwen en gewijzigd om afscheiding uit ER en in het medium van de celcultuur toe te laten die een zeer belangrijke eigenschap van deze mRNA-therapie is. Gebruikend mRNA therapie, kunnen wij de eigen cellen van het lichaam als fabriek gebruiken om proteã ne te synthetiseren, posttranslational het te wijzigen, en uiteindelijk het in de bloedstroom af te scheiden. Voorlopige analyse van celkweekmedium geeft aan dat de uitgescheiden SerpinA1 enzymatisch actief is in een neutrofielelastaseremmingstest (gegevens niet getoond). Onze gegevens in figuren 1, 2 en 3 suggereren dat de niveaus van SerpinA1-eiwit significant hoger zijn dan baseline-of negatieve controleniveaus. Deze niveaus moeten voldoende zijn om de neutrofielelastase-activiteit in plasma en de longen te verminderen en zo alveolaire afbraak en emfyseem, die kenmerkend zijn voor AATD, te voorkomen.

we hebben onze studies uitgebreid om te bepalen of mRNA-gecodeerde SERPINA1 in vivo kon worden uitgedrukt. Onze studies tonen aan dat intraveneus geïnjecteerd menselijk SERPINA1 mRNA zowel de lever als de longen bereikte bij WT muizen (figuren 3(A) en 3(b)). Aldus, kon de lipide-ingekapselde mRNA therapie potentieel beide plaatsen van AATD (lever en Long) richten. Nog belangrijker is dat humaan SerpinA1-eiwit werd geproduceerd in zowel de lever als de longen van WT-muizen (figuren 3(c) en 3(d)). Het SerpinA1 – eiwitexpressiepatroon in de lever sinusoïden geeft aan dat eiwitten worden afgescheiden door de hepatocyten of een ander leverceltype zoals stellaatcellen die SERPINA1 normaal uitdrukken. Onze gegevens kunnen de mogelijkheid niet uitsluiten dat mRNA binnengaat of door andere levercellen naast hepatocyten wordt uitgedrukt, en dit zal verder werk vereisen. Het is mogelijk dat het menselijke SerpinA1-eiwit in de longen uit twee bronnen zou kunnen komen: de serpina1 mRNA die via i.v. injectie de longen bereikte, evenals de afgescheiden menselijke SerpinA1 die door menselijke SERPINA1 mRNA in de lever wordt geproduceerd. In beide gevallen, is het potentieel voor SerpinA1 eiwituitdrukking en lokalisatie in de longen en lever veelbelovend aangezien het neutrofielelastase-gemedieerde schade in de longen kon blokkeren terwijl mogelijk het verminderen van PIZZ vormen in de lever. De laatste hypothese is gebaseerd op de studies van Karadagi et al. waarbij een toename van SerpinA1-eiwit door augmentatietherapie een afname van de PIZZ-vorm bij AATD-patiënten PBMC vertoonde. Dit verhoogt de mogelijkheid dat mRNA-gecodeerde SerpinA1 eiwit, wanneer uitgedrukt in de lever, hepatische productie van de PIZZ vorm kan verminderen en vervolgens hepatische fibrose remmen. Remming van leverfibrose en ER-stress kan uiteindelijk de behoefte van de AATD-patiënt aan een levertransplantatie verminderen/elimineren. Onze hypothese moet in vivo worden getest in een AATD-model dat leverfibrose en progressie tot hepatocellulair carcinoom aantoont.

hoewel dit spannende gegevens zijn, willen we erop wijzen dat mRNA-therapieën verbeterd moeten worden om mogelijk chronisch voordeel te bieden aan AATD-patiënten. De huidige halfwaardetijden voor exogenously geleverde mRNA zijn typisch 24-48h in weefsel, terwijl de eiwithalfwaardetijden afhankelijk van de proteã ne en zijn degradatieve mechanismen variëren. De strategieën om de halveringstijd van mRNAs te verhogen zijn momenteel in onderzoek en de vroege gegevens wijzen erop dat wij de duur van mRNA stabiliteit kunnen verhogen door UTRs flankerend codon-geoptimaliseerde mRNA te moduleren . De rationele eiwitengineering strategieën zijn ook gericht om verhoogde eiwithalfwaardetijd te vergemakkelijken die in verhoogde enzymatische activiteit en uiteindelijk een verminderde behoefte aan het doseren van de mRNA therapie resulteert . Deze nieuwe verbeteringen kunnen resulteren in een mRNA-therapie die zelden gedoseerd wordt en voldoende enzymactiviteit behoudt, bijvoorbeeld van SerpinA1-eiwit, om klinische verbetering te bieden. Een ander aspect dat mRNA therapieën zou verbeteren is de veiligheid van LNP levering waarbij we LNPs elke paar weken kunnen doseren. De huidige LNP-technologie vergemakkelijkt een eens-per-maand doseerregime, maar ondersteunt geen frequentere dosering als we dosering koppelen aan werkzaamheid. Zoals eerder vermeld, kunnen de LNP-ingekapselde mRNA therapieën, in tegenstelling tot sommige AAV-gentherapieën worden geherdoseerd, en de dosis kan worden getitreerd om maximaal geduldig voordeel te verstrekken.

5. Conclusie

onze studies presenteren het potentieel van een nieuwe therapeutische modaliteit, mRNA-therapie, waarbij een ontbrekende of niet-functionele proteïne kan worden vervangen om normale functies uit te voeren. Onze bevindingen tonen aan dat lipide-ingekapselde mRNA kan worden gericht op de longen en de lever die de twee primaire plaatsen van ziekte in AATD zijn. Terwijl de vorige studies die mRNA therapie voor AATD onderzoeken eiwituitdrukking bij 24h in a549 en hek293 cellen hebben getoond, tonen onze studies serpina1 eiwituitdrukking in aatd geduldige fibroblasten en patiënt-afgeleide hepatocytes aan die relevante cellijnen voor de ziekte zijn. Daarnaast breiden we eerdere studies op dit gebied uit door aan te tonen dat lipide-ingekapselde mRNA kan leveren aan muizenlever en longen en SerpinA1-eiwit kan produceren dat functioneel relevant is voor patiënten. Verder onderzoek moet worden uitgevoerd in een aatd-ziektemodel en om de veiligheid van meervoudige dosering van mRNA bij knaagdieren en hogere dieren te waarborgen alvorens deze modaliteit voor menselijk gebruik te overwegen. Samen genomen, verhogen onze studies de interessante mogelijkheid dat mRNA therapie die SERPINA1 mRNA gebruiken voordelig voor AATD patiënten zou kunnen zijn.

beschikbaarheid van gegevens

alle gegevens ter ondersteuning van de in dit artikel gepubliceerde resultaten worden in het artikel weergegeven. Er zijn geen andere gegevens beschikbaar.

belangenconflicten

alle auteurs zijn werknemers en aandeelhouders van Alexion Pharmaceuticals, Inc., een bedrijf dat therapieën ontwikkelt voor zeldzame en ultrarare ziekten.

bijdragen van auteurs

Brendan Connolly ontwierp en voerde celculturen, transfecties en in vivo monsterverwerking uit. Cleo Isaacs ontwierp en voerde IHC uit. Lei Cheng ontwierp en voerde ISH experimenten, handschrift schrijven, en in vivo studies. Kirtika H. Asrani voerde Western blots, immunoassays en in vivo monsterverwerking uit. Romesh R. Subramanian ontwierp experimenten, beoordeelde gegevens en schreef manuscript

Dankbetuigingen

Alexion Pharmaceuticals, Inc., wordt erkend voor financiering.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.