Articles

mRNA SERPINA1 w leczeniu niedoboru alfa-1 antytrypsyny

Streszczenie

niedobór alfa-1-antytrypsyny (AAT) jest zaburzeniem genetycznym, które powoduje nieaktywny/wadliwy AAT z powodu mutacji w genie SERPINA1 kodującym AAT. Choroba ta jest związana ze zmniejszoną aktywnością AAT w płucach i odkładaniem nadmiernie wadliwego białka AAT w wątrobie. Obecnie nie ma specyficznego leczenia chorób wątroby związanych z niedoborem AAT. Choroba płuc AAT jest często leczona jednym z kilku produktów zastępujących białko w surowicy; jednak długoterminowe badania skuteczności terapii zastępczej SerpinA1 nie są dostępne i nie zmniejsza uszkodzenia wątroby w niedoborze AAT. terapia mRNA może potencjalnie dotyczyć zarówno wątroby, jak i płuc pacjentów z niedoborem AAT. Fibroblasty pacjentów AAT i hepatocyty pochodzące od fibroblastów pacjentów AAT transfekowano mRNA kodującym serpina1, a pożywki do hodowli komórkowych testowano pod kątem ekspresji SerpinA1. Nasze dane pokazują wzrost białka SerpinA1 w pożywce hodowlanej z leczonych fibroblastów AAT pacjentów i hepatocytów pochodzących z fibroblastów AAT pacjentów. Badania In vivo na myszach typu dzikiego wykazują biodystrybucję mRNA SERPINA1 w wątrobie i płucach, jak również ekspresję białka SerpinA1 w tych dwóch narządach docelowych, które są krytycznie dotknięte niedoborem AAT. Zebrane razem dane sugerują, że terapia mRNA SerpinA1 może przynieść korzyści pacjentom cierpiącym na niedobór AAT.

1. Wprowadzenie

niedobór alfa-1-antytrypsyny (aatd) jest niszczycielską chorobą z brakiem odpowiednich terapii. Obecne terapie chronią tylko płuca, a w zaawansowanych przypadkach wymagają częstych wstrzyknięć dożylnych białka AAT pochodzącego z osocza. Pacjenci z AATD są predysponowani do obturacyjnej choroby płuc i choroby wątroby (np. marskość wątroby i rak wątrobowokomórkowy u dzieci i dorosłych) . Szacuje się, że u około 1-5% pacjentów z rozpoznaną przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP) występuje niedobór alfa-1-antytrypsyny . Chociaż niezwykle rzadko, u dzieci z AATD donoszono o rozedmie płuc, a częstość występowania chorób wątroby wzrasta wraz z wiekiem . Ciężkie objawy występują w późniejszym okresie życia, szczególnie u palaczy. Objawy wątrobowe AATD są widoczne pod koniec życia i często wymagają przeszczepu wątroby. AATD jest chorobą dziedziczną spowodowaną mutacjami w genie SERPINA1 . Gen SERPINA1 ma dwa allele oznaczone jako allele M (normalni pacjenci mają genotyp MM). Najczęstszym allelem powodującym ciężki niedobór AAT jest Z (E342K). Stwierdzono, że 95% pacjentów z ciężką AATD ma genotyp ZZ i tylko 10-20% serpina1 w surowicy . W przypadku mutacji ZZ białko SerpinA1 nie może się prawidłowo składać i nie będzie wydzielane przez hepatocyty; dlatego AATD nie jest spowodowane niezdolnością do wytwarzania białka, ale niezdolnością do wydzielania funkcjonalnego białka. Nagromadzenie SERPINA1 ZZ w hepatocytach powoduje ciężkie uszkodzenie wątroby . Pizza homozygotyczna jest dość powszechna i występuje w skali 1: 2500-3000 urodzeń w Ameryce Północnej i Europie.

alfa-1-antytrypsyna (AAT), znana również jako SERPINA1 (inhibitor proteazy serynowej, grupa a, członek 1), jest wydzielanym białkiem wytwarzanym głównie przez hepatocyty, a w mniejszym stopniu przez jednojądrzaste fagocyty, neutrofile i komórki nabłonka dróg oddechowych / jelit . SerpinA1 jest krążącą glikoproteiną, która jest również rozpuszczalna w wodzie i dyfuzyjna w tkankach . Podstawową rolą SerpinA1 jest regulacja proteazy serynowej, a głównym miejscem tego działania jest płuca. Tam SerpinA1 wiąże i inaktywuje elastazę neutrofilową, chroniąc tym samym tkanki pęcherzykowe przed degradacją proteolityczną podczas reakcji zapalnych . SerpinA1 jest najobficiej występującą w krążeniu anty proteazą, a normalne stężenie SerpinA1 w osoczu zwykle osiąga 1-2G / L .

AATD charakteryzuje się polimeryzacją źle złożonych białek SerpinA1 w szorstkim retikulum endoplazmatycznym hepatocytów, co zmniejsza stężenie i aktywność SerpinA1 we krwi i tkankach . U pacjentów z ciężkim niedoborem stężenie SerpinA1 w surowicy wynosi poniżej 50 mg/dL, podczas gdy prawidłowe stężenie wynosi 200 mg / dL. Przy niskim poziomie krążącej SerpinA1 płuca nie są chronione przed elastazą neutrofilową, enzymem, który niszczy pęcherzyki płucne i powoduje choroby płuc. Dlatego najczęstszymi powikłaniami klinicznymi AATD są rozedma płuc i choroby wątroby .

do tej pory dostępna jest tylko terapia augmentacyjna AAT w leczeniu AATD. Terapia augmentacyjna AAT została opracowana w 1987 r .i jest obecnie zatwierdzona tylko do użytku komercyjnego u wybranych pacjentów z ciężką rozedmą płuc związaną z AATD. AAT augmentation tylko pomaga dostarczyć SerpinA1 do płuc, gdzie może pomóc zapobiec uszkodzeniu elastazy neutrofilów. Ponieważ niedobór surowicy nie jest przyczyną uszkodzenia wątroby, nie ma specyficznego leczenia pacjentów cierpiących na choroby wątroby związane z AATD. Jedynym leczeniem jest leczenie podtrzymujące typowej niewydolności wątroby i przeszczepu wątroby u pacjentów z niewyrównaną marskością wątroby .

aatd jest zaburzeniem monogennym, co czyni go idealnym celem terapii mRNA. mRNA jest nowatorską modalnością, która może mieć zastosowanie w szerokim zakresie chorób ze względu na ogromną elastyczność w stosunku do tradycyjnych biologicznych i enzymatycznych terapii zastępczych. leki oparte na mRNA wykorzystują endogenną maszynę komórki gospodarza do produkcji i posttranslacyjnej modyfikacji białek docelowych, pozwalając na rozwój leków dla chorób, które wcześniej nie były kierowane. Przeprowadziliśmy badania in vitro i in vivo w celu określenia, czy możemy wyrazić egzogennie kodowaną Serpinę1 i skierować mRNA / białko do odpowiedniego organu.

terapia mRNA może potencjalnie dotyczyć zarówno wątroby, jak i płuc pacjentów z niedoborem AAT (w oczekiwaniu na bieżące eksperymenty). Nasze dane wykazały zwiększenie stężenia białka SerpinA1 w pożywkach do hodowli komórkowych leczonych fibroblastów pacjentów z AAT, a także w pożywkach do hodowli komórkowych pierwotnych hepatocytów pochodzących z fibroblastów pacjentów z AAT. Co więcej, u zwierząt WT otrzymujących mRNA SERPINA1 poprzez wstrzyknięcie dożylne, zarówno mRNA SERPINA1, jak i białko SerpinA1 były zlokalizowane zarówno w wątrobie, jak i płucach. Zebrane razem dane sugerują, że ekspresja białka SerpinA1 w płucach za pośrednictwem mRNA może hamować elastazę neutrofilów, podczas gdy może promować ekspresję izoformy MM w wątrobie i zapewniać wiele dróg korzyści dla pacjentów z AAT.

2. Materiały i metody

2.1. Fibroblasty pacjentów Aatd

warunki hodowli komórkowej. Następujące fibroblasty pacjentów uzyskano z Coriell Institute for Medical Research, Cell Repository (Camden, NJ): GM11423 i GM12445 z wątroby pacjenta aatd i GM02522 ze skóry pacjenta aatd i prawidłowej linii kontrolnej fibroblastu ND34769 ze skóry. Komórki hodowano w Minimum niezbędnym pożywce Eagle 'a z solami Earle’ a i nieistotnymi aminokwasami (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) uzupełnione 15% płodową surowicą bydlęcą i inkubowane w temperaturze 37°C w 5% CO2.

Warunki transfekcji. Pacjent fibroblasty transfekowano 2.5ug każdego mRNA i 4 µl mRNA – w odczynniku do transfekcji lipidów (MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD), w 3 niezależnych eksperymentach z 3 replikatami biologicznymi na eksperyment. Każdy mRNA rozcieńczono do 2,5 µg w OptiMEM (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) i podobnie odpowiednią objętość mRNA-In rozcieńczano w OptiMEM na studzienkę i przestrzegano protokołu zgodnie z zaleceniami producenta. Rozcieńczony mRNA zmieszano z rozcieńczonym lipidem i pozostawiono do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed dodaniem do komórek. Po dodaniu mieszaniny mRNA-lipidów do fibroblastów pacjentów, komórki zwrócono do inkubatora w temperaturze 37°C z 5% CO2. Po 24 godzinach komórki delikatnie przemywano dwukrotnie PBS i lizowano w świeżym buforze RIPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) z 1x inhibitorami proteazy (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO).

liza komórek i kwantyfikacja białka całkowitego: lizaty komórek fibroblastów pacjentów zebrano w probówkach o pojemności 0,5 mL (Eppendorf, Hamburg, Niemcy) i odwirowano w temperaturze 18000 X G w temperaturze 4°c w celu usunięcia resztek komórek. Po odwirowaniu przezroczysty supernatant ostrożnie przenoszono do oddzielnej oznakowanej probówki i umieszczano na lodzie. Całkowite stężenie białka oznaczono za pomocą zestawu testowego BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) w dwóch egzemplarzach w formacie 96-studzienkowym zgodnie z protokołem producenta.

Wes Automatyczna elektroforeza kapilarna do ekspresji SERPINA1. Końcowe próbki 5 µl każda przy stężeniu białka 0,4 mg/mL przygotowano zgodnie z instrukcjami producenta Protein Simple Wes. Lizaty analizowano za pomocą Protein Simple Wes size-based capillary electrophoresis system (ProteinSimple Wes; ProteinSimple, San Jose, CA). Oddzielone wielkością białka zbadano przeciwciałami specyficznymi dla SERPINA1 w rozcieńczeniu 1:125 (Novus Nbp1-90309, Novus Biologics, Littleton, CO) i Tioredoksyną gospodyni domowej w rozcieńczeniu 1: 1000 (CST 2429, Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), wizualizowane przy użyciu znakowanych wtórnych przeciwciał królika i oznaczane ilościowo za pomocą oprogramowania producenta. Dla każdego pasa pola pod krzywą (AUC) SERPINA1 znormalizowano do pola pod krzywą (AUC) kontrolnej Tioredoksyny.

2.2. Hepatocyty z niedoborem antytrypsyny alfa-1

warunki hodowli komórkowej. Hepatocyty pochodzące od pacjentów aatd zostały wytworzone z fibroblastów Aatd przez DefiniGen (Cambridge UK) przy użyciu zastrzeżonego protokołu różnicowania. Komórki hodowano w mediach DTM i DRM (DefiniGen, Cambridge UK) i platerowano 500 000 komórek na studzienkę w 24-studzienkowej płytce. Komórki hodowano w warunkach niedotlenienia w temperaturze 37°C w 5% CO2 i 5% O2, przy czym media były zmieniane co dwa dni przez 10 dni przed transfekcją w oparciu o zastrzeżony protokół producenta (DefiniGen, Cambridge UK). Komórki hodowano w warunkach niedotlenienia zgodnie z zaleceniami producenta, co umożliwiło wzrost komórek, podczas gdy warunki niedotlenienia zmniejszały wzrost komórek.

Warunki transfekcji i ekspresja białka metodą ELISA. Hepatocyty AATD transfekowano 4ul Lipofectamine® 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc ., Waltham, MA) na 2.5UG mRNA, w 3 niezależnych eksperymentach z 3 replikami biologicznymi na eksperyment. Następnie komórki inkubowano przez 24, 48 i 72 godziny przed usunięciem pożywki do hodowli komórkowej i oznaczono stężenie białka SerpinA1 za pomocą testu ELISA z Abcam (Cambridge, MA) i zgodnie z protokołem producenta.

2.3. Badania In Vivo

wszystkie eksperymenty, trzymanie zwierząt, obchodzenie się z nimi oraz procedury/protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z Alexion Pharmaceuticals Inc. Wytyczne i regulacje IACUC. W badaniu tym wykorzystano samce myszy C57BL/6 (w wieku 6 tygodni). Myszy trzymano w środowisku kontrolowanym temperaturą z cyklem 12-h/12-h światło-Ciemny, ze standardową dietą i wodą ad libitum.

formulacja mRNA do nanocząstek lipidowych i dawkowanie In Vivo. konstrukty mRNA zostały sformułowane przy użyciu samoskładającej się jonizowalnej nanocząstki lipidowej (LNP) zawierającej mRNA SERPINA1. GFP kodujący mRNA został użyty jako kontrola pojazdu obciążonego mRNA i PBS został użyty jako kontrola negatywna w tym eksperymencie. LNP otrzymano przez szybkie zmieszanie mRNA w buforze octanowym przy pH 4.0 z mieszanką lipidów, zestaw Hepato9 mRNA (precyzyjne Nanosystemy), zawieszony w etanolu w stosunku lipidów do leku wynoszącym ~11 (wt / wt). Zwierzętom wstrzyknięto pojedynczą dożylną dawkę 1,5 mg/kg mRNA przez żyłę ogonową. Zwierzęta uśmiercano 24 godziny po wstrzyknięciu, a tkanki utrwalano i przetwarzano w celu hybrydyzacji in situ (ISH) i immunohistochemii (IHC).

Pobieranie Próbek i przygotowanie próbek FFPE. Zwierzęta poddano sekcji, a lewy płat boczny umieszczono płasko w kasetach tkankowych (Fisher Scientific). Kasety umieszczono następnie w pojemniku wypełnionym 10% neutralnym buforowanym roztworem utrwalającym formalinę NBF (Sigma) w stosunku co najmniej 1:20 objętości tkanki w stosunku do roztworu utrwalającego. Próbki pozostawiono do ustalenia przez co najmniej 24 godziny, ale nie więcej niż 48 godzin w temperaturze pokojowej. Po zamocowaniu tkanki kasetę umieszczano w pojemniku wypełnionym PBS na nie więcej niż 3 dni. Po płukaniu PBS tkanki wątroby przetwarzano i osadzano w blokach parafinowych.

2.4. Immunohistochemię i hybrydyzację In Situ

Immunohistochemię SERPINA1 przeprowadzono na tkankach osadzonych w parafinie formaliny, 5 µm, z użyciem przeciwciała przeciwko SERPINA1 (Atlas, HPA001292 w 1:100). Immunosterowanie przeprowadzono na platformie Leica BOND RX (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) zgodnie ze standardowymi protokołami z odpowiednimi dodatnimi kontrolami. Pobieranie antygenów, standardowo na platformie Leica BOND RX, wykorzystywało rozwiązanie Leica ER1, EDTA-Tris, pH 8.0. Szkiełka odwodniono w serii stopniowego etanolu, oczyszczono w ksylen i zamontowano za pomocą Cytoseal. Szkiełka zostały sfotografowane za pomocą systemu VS120 w powiększeniu 40x (Olympus).

dla wizualizacji mRNA przeprowadzono hybrydyzację in situ (ISH). Niestandardowa sonda hybrydyzacji RNA in situ (Affymetrix, Santa Clara, CA)została zaprojektowana do wykrywania mRNA SERPINA1. Zautomatyzowany test RNA ISH przeprowadzono przy użyciu Viewrna EZ-L Detection Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA) i platformy Leica BOND RX (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL). Utrwalone formaliną, osadzone parafiną (FFPE) tkanki przygotowano w grubości 5 um na szkiełkach szklanych i założono na Leica BOND RX. Test ViewRNA eZ-L przeprowadzono zgodnie z protokołem manufacturers, ale krótko, RNA zdemaskowano 10-minutową inkubacją w temperaturze 95°C w roztworze Epitopu wiązania 1 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL), a następnie 20-minutową inkubacją z Proteinazą K z zestawu do wstępnej obróbki enzymu Wiązania w rozcieńczeniu 1:1000 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Hybrydyzację przeprowadzono rozcieńczeniem sondy SERPINA1 1: 40, a następnie detekcją FastRed. Aby zapewnić integralność RNA i procedurę testu, dodatkowe sekcje również hybrydyzowano z sondą dla izomerazy peptydylo-prolilowej B (PPIB), endogennego białka domowego stosowanego jako pozytywna Kontrola ISH. Aby kontrolować niespecyficzne barwienie, jako kontrolę negatywną zastosowano sondę kontrolną przeciwko reduktazie dihydrodypikolinianowej białka bakteryjnego (dapb). Wszystkie sondy były w rozcieńczeniu 1:40. Szkiełka osuszono na powietrzu, oczyszczono z ksylenu i zamontowano za pomocą Cytoseal. Szkiełka zostały sfotografowane za pomocą systemu VS120 w powiększeniu 40x (Olympus).

3. Wyniki

3.1. ekspresja ludzkiej SerpinA1 otrzymanej z mRNA w Lizatach komórkowych i pożywkach komórkowych chorych fibroblastów i pierwotnych hepatocytach otrzymywanych z fibroblastów

ludzkiego serpina1 mRNA z TriLink transfekowano do fibroblastów aatd, uzyskanych z Instytutu Coriella. Znaczny wzrost ekspresji białka ludzkiego SerpinA1 zaobserwowano w lizatach komórkowych (Fig.1(a)) i pożywkach do hodowli komórkowej (Fig. 1(b)) po transfekcji serpina1 typu dzikiego (WT) lub oznaczonego FLAG (FT).

(a)
(a)
(b)
(b)

(a)
(a)(b)
(b)

Figure 1
In vitro human SerpinA1 expression in cell lysates (a) and cell media (b) from AATD patient fibroblasts and normal skin fibroblasts. Vehicle control is GFP mRNA; WT-SERPINA1 is WT mRNA sequence; FT-SerpinA1 is flag-tagged mRNA sequence.

przeprowadzono również transfekcję mRNA ludzkiego SERPINA1 w pierwotnych hepatocytach pochodzących z fibroblastów uzyskanych z DefiniGen. Wydzielanie białka SerpinA1 WT do pożywki hodowlanej było zwiększone w ciągu 24 godzin w porównaniu do kontrolowanego tylko nośnikiem mRNA GFP. Obserwowaliśmy konsekwentny wzrost ekspresji białka SerpinA1 w czasie, jak widać po 48h i 72h po transfekcji (ryc. 2).

Figure 2
In vitro human SerpinA1 expression in cell culture media obtained from patient fibroblast-derived hepatocytes (DefiniGen, Cambridge UK).

3.2. In Vivo Human SerpinA1 Expression in WT Mice

Human SerpinA1 protein expression was subsequently evaluated in WT C57bl/6 mice. W wątrobie zaobserwowano ludzki mRNA SERPINA1(Fig.3 (a)), czego można się spodziewać, biorąc pod uwagę, że mRNA jest zamknięty w nanocząstce lipidowej, która zazwyczaj dostarcza dużą ilość swojego ładunku do wątroby. Intrygującym odkryciem było, że mRNA SERPINA1 Wykryto również w płucach myszy (Fig. Ekspresję białka SerpinA1 wykryto stosując ludzkie specyficzne przeciwciało SerpinA1. Białko SerpinA1 obserwowano zarówno w wątrobie (Fig. 3 (c)), jak i w płucach(Fig.3 (d)). Sinusoidalny wzór ekspresji białka SerpinA1 w wątrobie wskazuje, że białko SerpinA1 jest prawdopodobnie wydzielane do krwi przez hepatocyty.

(b)

(c)(wiersz)

(d)(d)

(a)
(a)(b)
(b)(usuń)
(d)
(d)
rozkład mrna serpina1 człowieka in vivo w wątrobie(a) i płuc(b) wt mippa przez 24 godziny po dożylnym podaniu było детоксифицировано się w odwrotny sposób. Czerwone kropki na obrazku reprezentują mRNA. Białko SerpinA1 było wizualizowane w wątrobie (c) i płucach (d) przez IHC.

4. Dyskusja

AATD to wyniszczająca choroba, która wymaga skutecznych terapii z korzyścią dla pacjentów. Obecna terapia augmentacyjna jest niewystarczająca, aby uniknąć długotrwałego uszkodzenia wątroby pacjentów z AATD. Obecnie wiele grup są realizacji nowych modalności, aby zapewnić bardzo potrzebne terapie, takie jak terapia genowa. Na przykład, przeszczep komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego został przetestowany na myszach AATD i wykazał pewne ratowanie pogorszenia hepatocytów . Strategie wymiany genów są również testowane w klinice, w której Gen SERPINA1 WT jest wprowadzany do wątroby i wyraża odpowiednie białko SerpinA1. Obecne metody nadal muszą być zoptymalizowane i AAV pośredniczy w dostarczaniu genu może powodować zmniejszenie wydzielania białka przez przeciwciała lub reakcję immunologiczną na wirusowy kapsyd.

oceniliśmy efekt przejściowej ekspresji mRNA SERPINA1 w wątrobie myszy, ponieważ dostarczanie mRNA do wątroby jest stosunkowo proste i ustalane za pomocą nanocząstek lipidowych (LNP) i możemy podawać mRNA w kapsułce LNP bez znaczących reakcji immunologicznych. Początkowo testowaliśmy naszą hipotezę w fibroblastach pacjentów z AATD i pierwotnych hepatocytach pochodzących z fibroblastów. Nasze dane wyraźnie pokazują, że możemy kodować SERPINA1 z mRNA, a następnie ekspresować białko SerpinA1 z obu typów komórek. Wykazujemy również, że białko SerpinA1 jest wydzielane z tych komórek i poziom białka można zmierzyć w supernatancie / pożywce do hodowli komórkowej. Oznacza to, że kodowane mRNA białko SerpinA1 jest składane i odpowiednio modyfikowane w komórce, aby umożliwić wydzielanie z ER do pożywki do hodowli komórkowej, co jest kluczową cechą tej terapii mRNA. Wykorzystując terapię mRNA, możemy wykorzystać własne komórki organizmu jako fabrykę do syntezy białka, modyfikacji posttranslacyjnej, a na koniec wydzielania go do krwiobiegu. Wstępna analiza pożywki do hodowli komórkowej wskazuje, że wydzielana SerpinA1 jest aktywna enzymatycznie w teście hamowania elastazy neutrofilowej (dane nie pokazane). Nasze dane na rysunkach 1, 2 i 3 sugerują, że poziomy białka SerpinA1 są znacznie wyższe niż początkowe lub negatywne poziomy kontrolne. Poziomy te powinny być wystarczające do zmniejszenia aktywności elastazy neutrofilów w osoczu i płucach, a tym samym do zapobiegania degradacji pęcherzyków i rozedmy płuc, które są charakterystyczne dla AATD.

rozszerzyliśmy nasze badania, aby ustalić, czy serpina1 kodowana mRNA może być wyrażona in vivo. Nasze badania pokazują, że dożylnie wstrzykiwany ludzki mRNA SERPINA1 dotarł zarówno do wątroby, jak i płuc u myszy WT(Fig. 3(A) i 3 (b)). Tak więc terapia mRNA w kapsułkach lipidowych może potencjalnie dotyczyć obu miejsc AATD (wątroby i płuc). Co ważniejsze, ludzkie białko SerpinA1 było wytwarzane zarówno w wątrobie, jak i płucach myszy WT (Fig.3(C) i 3(d)). Wzorzec ekspresji białka SerpinA1 w sinusoidach wątroby wskazuje, że białka są wydzielane przez hepatocyty lub inny typ komórek wątroby, takich jak komórki gwiaździste, które normalnie wyrażają SERPINA1. Nasze dane nie wykluczają możliwości przedostania się mRNA lub jego ekspresji przez inne komórki wątroby poza hepatocytami, co będzie wymagało dalszych prac. Możliwe, że ludzkie białko SerpinA1 w płucach może pochodzić z dwóch źródeł: mRNA SERPINA1, który dotarł do płuc poprzez wstrzyknięcie dożylne, jak również wydzielana ludzka SerpinA1 wytwarzana przez mRNA ludzkiego SERPINA1 w wątrobie. W obu przypadkach potencjał ekspresji i lokalizacji białka SerpinA1 w płucach i wątrobie jest obiecujący, ponieważ może blokować uszkodzenia spowodowane elastazą neutrofilową w płucach, podczas gdy możliwe jest zmniejszenie form PIZZ w wątrobie. Ta ostatnia hipoteza opiera się na badaniach Karadagi et al. w którym zwiększenie stężenia białka SerpinA1 poprzez terapię augmentacyjną wykazało zmniejszenie postaci PIZZ u pacjentów z AATD PBMC. Zwiększa to możliwość, że kodowane mRNA białko SerpinA1, ulegające ekspresji w wątrobie, może zmniejszać wątrobowe wytwarzanie formy pizzy, a następnie hamować zwłóknienie wątroby. Hamowanie zwłóknienia wątroby i stresu ER może ostatecznie zmniejszyć / wyeliminować potrzebę przeszczepu wątroby u pacjentów z AATD. Nasza hipoteza musi zostać przetestowana in vivo w modelu AATD, który wykazuje zwłóknienie wątroby i progresję do raka wątrobowokomórkowego.

chociaż są to ekscytujące dane, chcielibyśmy podkreślić, że terapie mRNA muszą zostać ulepszone, aby potencjalnie zapewnić przewlekłe korzyści pacjentom z AATD. Obecne okresy półtrwania egzogennie dostarczonego mRNA wynoszą zazwyczaj 24-48h w tkance, podczas gdy okresy półtrwania białek różnią się w zależności od białka i jego mechanizmów degradacyjnych. Strategie zwiększające okres półtrwania mRNA są obecnie badane i wczesne dane wskazują, że możemy wydłużyć czas trwania stabilności mRNA poprzez modulowanie UTRs flankując kodon zoptymalizowany mRNA . Racjonalne strategie inżynierii białka są również ukierunkowane na ułatwienie zwiększonego okresu półtrwania białka, co skutkuje zwiększoną aktywnością enzymatyczną i ostatecznie zmniejszoną potrzebą dawkowania terapii mRNA . Te nowe ulepszenia mogą prowadzić do terapii mRNA, która jest podawana rzadko i utrzymuje wystarczającą aktywność enzymu, np. białka SerpinA1, aby zapewnić poprawę kliniczną. Innym aspektem, który poprawiłby terapię mRNA, jest bezpieczeństwo dostarczania LNP, dzięki któremu możemy dawkować LNPs co kilka tygodni. Obecna technologia LNP ułatwia system dawkowania raz na miesiąc, ale nie obsługuje częstszego dawkowania, jeśli sparujemy dawkowanie ze skutecznością. Jak wspomniano wcześniej, terapie mRNA w kapsułkach LNP można redukować, w przeciwieństwie do niektórych terapii genowych AAV, a dawkę można zwiększać, aby zapewnić maksymalne korzyści dla pacjenta.

5. Wnioski

nasze badania pokazują potencjał nowej metody terapeutycznej, terapii mRNA, w ramach której brakujące lub niefunkcjonalne białko może zostać zastąpione w celu realizacji normalnych funkcji. Nasze wyniki pokazują, że mRNA zamknięte w lipidach mogą być skierowane do płuc i wątroby, które są dwoma głównymi miejscami choroby w AATD. Podczas gdy poprzednie badania badające terapię mRNA dla aatd wykazały ekspresję białka w 24h w komórkach a549 i HEK293, nasze badania wykazują ekspresję białka SerpinA1 w fibroblastach pacjentów aatd i hepatocytach pochodzących od pacjentów, które są odpowiednimi liniami komórkowymi dla choroby. Ponadto rozszerzamy poprzednie badania w tej dziedzinie, wykazując, że mRNA w kapsułkach lipidowych może dostarczać do wątroby i płuc myszy i wytwarzać białko SerpinA1, które ma znaczenie funkcjonalne dla pacjentów. Dalsze badania muszą być prowadzone w modelu choroby AATD i w celu zapewnienia bezpieczeństwa wielokrotnego dawkowania mRNA u gryzoni i zwierząt wyższych przed rozważeniem tego sposobu stosowania u ludzi. Łącznie nasze badania podnoszą interesującą możliwość, że terapia mRNA z wykorzystaniem mRNA SERPINA1 może być korzystna dla pacjentów z AATD.

dostępność danych

wszystkie dane wspierające wyniki opublikowane w tym artykule są przedstawione w artykule. Brak innych danych.

konflikty interesów

wszyscy autorzy są pracownikami i udziałowcami Alexion Pharmaceuticals, Inc., firma zajmująca się opracowywaniem terapii chorób rzadkich i ultrarare.

wkład autorów

Brendan Connolly zaprojektował i przeprowadził hodowlę komórek, transfekcje i przetwarzanie próbek in vivo. Cleo Isaacs zaprojektował i przeprowadził IHC. Lei Cheng zaprojektował i przeprowadził eksperymenty ISH, pisanie rękopisów i badania in vivo. Kirtika H. Asrani wykonywała western blots, testy immunologiczne i przetwarzanie próbek in vivo. Romesh R. Subramanian zaprojektował eksperymenty, przejrzał Dane i był autorem manuskryptu

podziękowania

Alexion Pharmaceuticals, Inc., jest zatwierdzona do finansowania.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.