Articles

FIXATION

BOT/MICRO/ZOO 5364

PREPARATION OF BIOLOGICAL SPECIMENS

FIXATION

Fixation of tissues is the most crucial step in thepreparation of tissue for observation in the transmission electron microscope. Fixation consists of two steps: cessação das funções de vida normal na substância (occisão) e estabilização da estrutura do tecido(preservação). O objetivo da fixação é preservar a estrutura tão fielmente quanto possível em comparação com o estado vivo. Os três parâmetros mais importantes a recordar sobre a fixação são: (1) manter o tempo entre a occisão e a fixação no mínimo. (2) manter o tamanho do tecido o mais pequeno possível sem perder a informação ou destruir o tecido. Se um espécime Grande tiver de ser fixado, a sua dimensão deve ser inferior a 1 mm, ou então cortar áreas do espécime que possam ser removidas de modo a que o fixador possa penetrar. A penetração efectiva do fixativeé de cerca de 0,5 mm para o ósmio. 3) reduzir ao mínimo a deformação bruta dos tecidos, utilizando instrumentos cortantes e mantendo a manipulação da amostra ao mínimo necessário.

devem ser feitos todos os esforços para garantir que o tecido é keptmoist num meio fisiológico até ser fixado. Dissecação em fixativo pode ser usado se a manipulação do espécime é demorado. Tamanho Ideal do espécime. ou menos (tamanho real). se o espécime flutuar, deve ser submerso. Em alguns casos, isto pode ser feito mergulhando o espécime em um agente molhante breve antes da fixação ou adicionando um agente molhante à solução fixativa. Se for adicionado um agente de activação ao fixador, tente transferir o espécime para o fixador de cresh o mais rapidamente possível. Uma vez que o ar preso é muitas vezes a causa de sua tela flutuando no fixativo, o ar pode às vezes ser removido pelo partialvacuum. No entanto, isso às vezes é prejudicial para o espécime. Mais gentleapproach é simplesmente colocar um plug de Kimwipe abaixo da superfície do fixador,assim, a interceptação de a amostra abaixo da superfície da solução de fixador. uma vez a amostra fixada, utilize o mesmo frasco para injectáveis através da pré-preparação. Decantar simplesmente (ou pipetar) o conteúdo do frasco para injectáveis antes de cada alteração. Algumas pessoas preferem usar um aspirador para acelerar este processo. Uma vez que o tecido perdido no aspirador é irremediável, os principiantes seriam aconselhados a não utilizar oaspirador até que sejam experimentados com o material de manipulação. fixadores são os mais utilizados frescos. Suponha que todos os fixadores são pelo menos ligeiramente fotoactivos e que todos são sensíveis à oxidação no ambiente. Por esta razão, os fixadores são mantidos no frigorífico ou no frigorífico e aquecidos à temperatura ambiente imediatamente antes da utilização. As soluções de preparação comercial são embaladas em gás nitrogênio. glutaraldeído é normalmente límpido e tem um aroma Adoçante. (Mas não saia do seu caminho para cheirá-lo, pois também é um efeito fixador como um vapor.) Glutaraldeído pode degradar – se em ácido glutárico, que é amarelo claro em cor. A fixação do glutaraldeído pode ter lugar à temperatura ambiente ou no frigorífico durante 2 horas (para o material extremamente pequeno), 6 horas (padrão) ou mais, se necessário. Algumas pessoas mantêm o materialin GA por semanas a anos, e se ele degrada o material, a degradação pode não ser óbvia. (A utilização de GA como solução de exploração deve ser considerada como um lastresort.) Osmium tetroxide is a straw-colored crystal, which whenmixed with water results in a similarly colored solution. Só deve ser fundido num capuz de fumo. O ósmio é extremamente caro, pelo que cada amostra deve utilizar apenas 1 – 2 ml de solução durante a fixação. É altamente labile na temperatura do quarto e todo o material de vidro utilizado na sua preparação deve ser lavado a ácido prior para usar para remover compostos orgânicos que causarão a sua degradação. Osmiumtetroxide in the presence of light, heat, or organic materials will be converted to osmium dioxide, a black compound which is inefective at fixingmaterials. As soluções de ósmio usado e de ósmio preto devem ser descartadas num recipiente especial de resíduos no exaustor de fumos. Os vapores de ósmio são extremamente eficazes na fixação das membranas mucosas e devem ser considerados como um perigo no laboratório. Toda fixação de ósmio deve ser realizada no frio por até 2 horas — não mais.

DESIDRATAÇÃO

Desidratação é a substância química, remoção de água thespecimen. Fluidos desidratantes comuns são etanol e acetona. Os potenciais problemas de desidratação são a diminuição do espécime, a plasmólise e a remoção dos componentes solúveis do espécime. A desidratação deve ser conduzida rapidamente, a fim de evitar a extracção excessiva de compostos solúveis em álcool e acetona, mas suficientemente lenta para prevenir a plasmólise.

a extracção dos componentes das amostras é difícil de controlar. Os hidratos de carbono de baixo peso molecular são particularmente susceptíveis, uma vez que os hidratos de carbono são geralmente mal ligados entre si, se de todo após a fixação. As proteínas tendem a ser reticuladas pelo glutaraldeído durante a fixação primária e os lípidos pelo tetroxide de ósmio durante a fixação secundária. Os “carbohidratados” não estão essencialmente misturados. O problema da extracção Está ligado ao da retinagem. Ambos os problemas são mais graves em concentrações baixas na série de drogas. Em geral, a desidratação rápida é melhor por estas razões. por 70% de álcool, o tecido já não encolhe tanto, mas começa a endurecer. De facto, períodos prolongados de desidratação nas concentrações mais elevadas de álcool podem tornar o tecido bastante frágil. Se for necessário um ponto de paragem, a maioria dos histólogos escolhe 70% a 100% de álcool como um bom lugar para parar à noite. Se houver evidência de plasmólise, talvez possam ser necessários passos adicionais deehydration (e / ou alterações maiores). Por vezes, os membranas celulares mantêm alguma actividade osmótica após curtos períodos de fixação. Longos períodos de fixação no glutaraldeído também podem reduzir a sensibilidade osmótica. (Membranas são essencialmente insensíveis a alterações osmóticas após 48 horas de offixation no glutaraldeído.) A má fixação causará problemas com a droga. desidratação à temperatura do frigorífico atrasa um pouco o processo e tende a dar alguma rigidez ao tecido. Pode também reduzir o plasmolysisslightly. As plantas são as mais sensíveis à desidratação pobre e, portanto, é preferível a desidratação refrigerada para estes tecidos. ao mudar as soluções, certifique-se de que a amostra não seca. Portanto, a maioria dos trabalhadores não pipetar o fundo do frasco drybet between mudanças, mas deixar um pouco de líquido para manter os espécimes secos. Com base em volumes relativos, esta solução remanescente é inconsequente. para misturar soluções de álcool, o álcool a 95% é utilizado porque o consumo de 100% seria proibitivamente caro. A utilização de álcool a 95% para tornar os fluidos sedativos pode ser confusa, mesmo com a ajuda de uma calculadora. Portanto, os histólogos desenvolveram um atalho para estes cálculos: a quantidade de álcool necessária é calculada como se estivesse a utilizar 100% (por exemplo, para produzir cerca de 100 ml de álcool a 70%, adiciona 70 ml a um cilindro graduado). Em seguida, o volume final da solução é reduzido em 5%. (Neste exemplo, adiciona-se 25 mlof de água, perfazendo 95 ml de álcool a 70% em vez de 100 ml). Isto é tão exato quanto adicionar os 73,68 ml de álcool 95% que seriam necessários para fazer 100 ml de solução de 70%, e é muito mais rápido.

INFILTRAÇÃO

Infiltração é a substituição da desidratação fluido ortransition solvente com resina plástica. No caso da Epon 812 e da resina de Spurr, são utilizadas sucessivamente alterações de 1/3 da resina, 2/3 da resina e 100% da resina. Os passos na infiltração são menos porque menos dano é feito ao espécime durante esta fase. O objectivo da infiltração é simplesmente a penetração completa da resina no espécime.

as soluções de resina e solvente são preparadas imediatamente antes da utilização e adicionadas ao frasco para injectáveis da amostra. As soluções de resina residual são descartadas num recipiente especial no exaustor de fumos. As resinas podem ser conservadas no congelador entre utilizações; no entanto, devem poder ser aquecidas a fundo antes da abertura do recipiente, uma vez que a água se condensará com resina fria. o uso de rotação lenta ajudará a penetração da resina no bloco tecidular. A qualidade da penetração só pode ser avaliada após a sua constituição. Em geral, um período de infiltração um pouco mais longo é melhor do que uma infiltração menor.

INCORPORAÇÃO

Incorporação envolve o posicionamento final do tissuespecimen no líquido de plástico e de sua posterior polimerização. Três tipos de moldes são comumente usados na incorporação: (1) cápsulas pequenas, como gelatincapsules ou cápsulas especiais de bemas de plástico; (2) moldes de incorporação planos; (3) flatdishes. Cada um tem suas próprias vantagens e desvantagens. A incorporação é o passo crucial para determinar a orientação do seccionamento. As cápsulas de Beem e odgelatina são ideais quando o espécime não tem polaridade, ou quando o especimen se orientará pela gravidade. Para as amostras de partículas, estão disponíveis pastilhas especiais com paredes íngremes e uma extremidade estreita. Os moldes de incorporação plana são preferíveis quando a amostra deve ser orientada numa posição específica no plástico líquido. Isto permite preparar secções transversais e longitudinais precisas e ajuda a alinhar a amostra. O prato plano é útil quando o especimen é grande, quando a orientação do espécime é impraticável, ou quando massas massivas de material são escaneadas para selecionar uma amostra para a seção. O pequeno chip plástico que contém a amostra desejada deve então ser serrado do bloco e colado a uma cavilha ou peça de plástico fundido para seccionamento.

a identificação dos blocos é facilmente realizada e absolutamente necessária. Utilizando uma máquina de escrever ou de lápis, escrever os dados relevantes numa pequena folha de papel ou cartão para inserir na cápsula ou molde antes de incorporar. Com cápsulas, as seguintes orientações são úteis:

Deixe uma resposta

O seu endereço de email não será publicado.