Articles

SERPINA1 ARNm ca tratament pentru deficitul de antitripsină alfa-1

rezumat

deficitul de alfa-1-antitripsină (AAT) este o tulburare genetică care produce AAT inactiv / defect datorită mutațiilor genei SERPINA1 care codifică AAT. Această boală este asociată cu scăderea activității AAT în plămâni și depunerea de proteine AAT defecte excesive în ficat. În prezent, nu există un tratament specific pentru boala hepatică asociată cu deficiența AAT. Boala pulmonară AAT este adesea tratată cu unul dintre mai multe produse de înlocuire a proteinelor serice; cu toate acestea, studiile pe termen lung privind eficacitatea terapiei de substituție SerpinA1 nu sunt disponibile și nu reduc leziunile hepatice în deficiența AAT. terapia cu ARNm ar putea viza atât ficatul, cât și plămânii pacienților cu deficit de AAT. Fibroblastele pacientului AAT și hepatocitele derivate din fibroblaste ale pacientului AAT au fost transfectate cu ARNm care codifică SERPINA1, iar mediile de cultură celulară au fost testate pentru expresia SerpinA1. Datele noastre demonstrează creșterea proteinei SerpinA1 în mediile de cultură din fibroblastele tratate ale pacienților AAT și hepatocitele derivate din fibroblaste ale pacienților AAT. Studiile in vivo la șoareci de tip sălbatic demonstrează biodistribuția ARNm SERPINA1 în ficat și plămâni, precum și expresia proteinei SerpinA1 în aceste două organe țintă care sunt afectate critic în deficiența AAT. Luate împreună, datele noastre sugerează că terapia cu ARNm SerpinA1 are potențialul de a beneficia pacienții care suferă de deficiență AAT.

1. Introducere

deficitul de alfa-1-antitripsină (AATD) este o boală devastatoare, cu o lipsă de terapii adecvate. Terapiile actuale protejează numai plămânii și, în cazuri avansate, necesită injecții intravenoase frecvente de proteine AAT derivate din plasmă. Pacienții cu AATD sunt predispuși la boli pulmonare obstructive și boli hepatice (de exemplu, ciroză și carcinom hepatocelular la copii și adulți) . Se estimează că aproximativ 1-5% dintre pacienții cu boală pulmonară obstructivă cronică diagnosticată (BPOC) au deficit de alfa-1-antitripsină . Deși este extrem de rar, emfizemul la copiii cu AATD a fost raportat și incidența bolilor hepatice crește odată cu vârsta . Simptomele Severe apar mai târziu în viață, în special la fumători. Simptomele hepatice ale AATD sunt observate târziu în viață și necesită adesea transplant hepatic. AATD este o boală moștenită cauzată de mutații în cadrul genei SERPINA1 . Gena SERPINA1 are două alele desemnate ca alele M (pacienții normali au un genotip MM). Cea mai comună alelă care duce la deficiență severă AAT se numește Z (E342K) . S-a raportat că 95% dintre pacienții cu AATD severă au un genotip de ZZ și au doar 10-20% din nivelurile SERPINA1 SERPINA1 . În cazurile de mutație ZZ, proteina SerpinA1 nu se poate plia corect și nu va fi secretată de hepatocite; prin urmare, AATD nu este cauzată de incapacitatea de a produce proteine, ci de incapacitatea de a secreta proteine funcționale. Acumularea de zz SerpinA1 în hepatocite are ca rezultat leziuni hepatice severe . Pizzul homozigot este destul de comun și apare la 1:2500-3000 de nașteri în America de Nord și Europa.

alfa-1-antitripsina (AAT), cunoscută și sub numele de SERPINA1 (inhibitor de serină protează, grupa A, membru 1), este o proteină secretată produsă în principal de hepatocite și într-o măsură mai mică de fagocite mononucleare, neutrofile și celule epiteliale ale căilor respiratorii / intestinale . SerpinA1 este o glicoproteină circulantă, care este, de asemenea, solubilă în apă și difuzibilă tisulară . Rolul principal al SerpinA1 este reglarea serin proteazei, iar locul principal al acestei acțiuni este în plămâni. Acolo, SerpinA1 leagă și inactivează elastaza neutrofilă, protejând astfel țesuturile alveolare de degradarea proteolitică în timpul răspunsurilor inflamatorii . SerpinA1 este cea mai abundentă anti-protează circulantă, iar concentrațiile plasmatice normale ale SerpinA1 ating de obicei 1-2g/L .

AATD se caracterizează prin polimerizarea proteinelor SERPINA1 pliate greșit în reticulul endoplasmatic dur al hepatocitelor care scade concentrația și activitatea SerpinA1 în sânge și țesuturi . Pentru pacienții cu deficiență severă, nivelurile serice SerpinA1 sunt sub 50 mg/dL, în timp ce nivelurile normale sunt la 200 mg/dl. Cu niveluri scăzute de serpină circulantă1, plămânii nu sunt protejați de elastaza neutrofilă, o enzimă care distruge alveolele și provoacă boli pulmonare. Prin urmare, cele mai frecvente complicații clinice ale AATD sunt emfizemul pulmonar și boala hepatică .

până în prezent, numai terapia de augmentare AAT este disponibilă pentru tratamentul AATD. Terapia de augmentare AAT a fost dezvoltată în 1987 și este aprobată în prezent doar pentru utilizare comercială la pacienții selectați cu emfizem pulmonar sever legat de AATD . Augmentarea AAT ajută doar la furnizarea SerpinA1 plămânilor, unde poate ajuta la prevenirea deteriorării elastazei neutrofile. Deoarece deficitul de ser nu este cauza afectării hepatice, nu există un tratament specific pentru pacienții care suferă de boli hepatice asociate cu AATD. Singurul tratament este îngrijirea de susținere pentru insuficiența hepatică tipică și transplantul de ficat pentru pacienții cu ciroză decompensată .AATD este o tulburare monogenică care o face o țintă ideală pentru terapia ARNm. ARNm este o modalitate nouă care este potențial aplicabilă pentru o gamă largă de boli datorită flexibilității sale enorme față de terapiile tradiționale biologice și de substituție enzimatică. terapia bazată pe ARNm utilizează mecanismul endogen al celulei gazdă pentru producerea și modificarea posttranslațională a proteinelor țintă, permițând dezvoltarea terapiei pentru bolile care nu erau vizate anterior. Am efectuat studii in vitro și in vivo pentru a determina dacă am putea exprima serpina codificată exogen1 și să direcționăm ARNm/proteina către organul adecvat.

terapia ARNm ar putea viza atât ficatul, cât și plămânii pacienților cu deficit de AAT (în așteptarea experimentelor actuale). Datele noastre au demonstrat creșterea proteinei SerpinA1 în mediile de cultură celulară ale fibroblastelor tratate ale pacienților cu AAT, precum și în mediile de cultură celulară ale hepatocitelor primare derivate din fibroblaste ale pacienților cu AAT. Mai mult, la animalele WT cărora li s-a administrat ARNm SERPINA1 prin injecție intravenoasă, s-a observat că atât ARNm SERPINA1, cât și proteina SerpinA1 sunt localizate atât în ficat, cât și în plămâni. Luate împreună, datele noastre sugerează că expresia mediată de ARNm a proteinei SerpinA1 în plămâni ar putea inhiba elastaza neutrofilă, în timp ce ar putea promova expresia izoformă MM în ficat și ar oferi mai multe căi de beneficiu pentru pacienții cu AAT.

2. Materiale și metode

2.1. Fibroblaste pacient AATD

condiții de cultură celulară. Următoarele fibroblaste ale pacienților au fost obținute de la Institutul Coriell pentru Cercetări Medicale, Cell Repository (Camden, NJ): GM11423 și GM12445 de la ficatul pacientului aatd și GM02522 de la pielea pacientului aatd și linia normală de control a fibroblastelor ND34769 de la piele. Celulele au fost cultivate în mediul esențial minim al Eagle cu sărurile lui Earle și aminoacizii neesențiali (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) suplimentat cu 15% ser fetal bovin și incubat la 37 CTC în 5% CO2.

condiții de transfecție. Fibroblastele pacientului au fost transfectate cu 2.5UG din fiecare ARNm și 4 unqql de ARNm în reactiv de transfecție lipidică (MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD), în 3 experimente independente cu 3 replici biologice pe experiment. Fiecare ARNm a fost diluat la 2,5% în OptiMEM (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) și un volum similar adecvat de ARNm-In a fost diluat în OptiMEM per godeu și protocolul a fost urmat conform recomandărilor producătorului. ARNm diluat a fost amestecat cu lipide diluate și lăsat să se incubeze timp de 15 minute la temperatura camerei înainte de a se adăuga la celule. După adăugarea amestecului ARNm-lipidic la fibroblastele pacientului, celulele au fost readuse în incubator la 37 C cu 5% CO2. După 24 de ore, celulele au fost spălate ușor cu PBS de două ori și lizate în tampon RIPA proaspăt (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) cu inhibitori de protează 1X (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

liza celulară și cuantificarea totală a proteinelor: lizele celulare fibroblaste ale pacientului au fost colectate în tuburi de 0,5 mL (Eppendorf, Hamburg, Germania) și centrifugate la 18000 x g la 4 centi C pentru a îndepărta resturile celulare. După centrifugare, supernatantul limpede a fost transferat cu grijă într-un tub separat etichetat și plasat pe gheață. Concentrația totală de proteine a fost determinată cu ajutorul kitului de testare BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) în dublu exemplar în format de 96 de puțuri conform protocolului producătorului.

Wes electroforeză capilară automată pentru expresia SERPINA1. Probele finale a câte 5 unqql fiecare la o concentrație de proteine de 0,4 mg/mL au fost preparate conform instrucțiunilor producătorului Protein Simple Wes. Lizatele au fost analizate folosind sistemul de electroforeză capilară Protein simple Wes (ProteinSimple Wes; ProteinSimple, San Jose, CA). Proteinele separate de dimensiuni au fost probate cu anticorpi specifici pentru SERPINA1 la diluția 1:125 (Novus NBP1-90309, Novus Biologics, Littleton, CO) și menajera Tioredoxină la 1: 1000 (CST 2429, cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), vizualizat folosind anticorpi secundari de iepure etichetați și cuantificat folosind software-ul producătorilor. Pentru fiecare bandă, zona de sub curbă (ASC) a SERPINEI 1 a fost normalizată la ASC a controlului Tioredoxinei.

2.2. Hepatocite cu deficit de antitripsină alfa-1

condiții de cultură celulară. Hepatocitele derivate din aatd au fost generate din fibroblaste AATD de DefiniGen (Cambridge UK) folosind un protocol de diferențiere proprietar. Celulele au fost cultivate în medii DTM și medii DRM (DefiniGen, Cambridge UK) și placate la 500.000 de celule pe godeu într-o placă de 24 de puțuri. Celulele au fost crescute în condiții hipoxice la 37 C în 5% CO2 și 5% O2, mediul fiind schimbat la fiecare două zile timp de 10 zile înainte de transfecție pe baza protocolului producătorului proprietar (DefiniGen, Cambridge UK). Celulele au fost cultivate în condiții hipoxice conform instrucțiunilor producătorului, ceea ce a permis creșterea celulelor, în timp ce condițiile nonhipoxice au redus creșterea celulelor.

condițiile de transfecție și expresia proteinelor prin ELISA. Hepatocitele AATD au fost transfectate cu 4UL de Lipofectamină 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) PE 2.5UG ARNm, în 3 experimente independente cu 3 replici biologice pe experiment. Celulele au fost apoi incubate timp de 24, 48 și 72 de ore înainte ca mediile de cultură celulară să fie îndepărtate și testate pentru concentrația proteinei SerpinA1 folosind un ELISA de la Abcam (Cambridge, MA) și urmând protocolul producătorului.

2.3. Studii in Vivo

toate experimentele, adăpostirea animalelor, manipularea și procedurile / protocoalele experimentale au fost aprobate și efectuate în conformitate cu Alexion Pharmaceuticals Inc. Orientări și reglementări IACUC. C57bl / 6 șoareci masculi (în vârstă de 6 săptămâni) au fost utilizați în acest studiu. Șoarecii au fost ținuți într-un mediu cu temperatură controlată, cu un ciclu lumină-întuneric de 12 ore/12 ore, cu o dietă standard și apă ad libitum.

formularea ARNm în nanoparticule lipidice și dozare in Vivo. construcțiile ARNm au fost formulate folosind o nanoparticulă lipidică ionizabilă auto-asamblabilă (LNP) care conține ARNm SERPINA1. Un ARNm care codifică GFP a fost utilizat ca control al vehiculului încărcat cu ARNm, iar PBS a fost utilizat ca control negativ în acest experiment. LNP-urile au fost preparate prin amestecarea rapidă a ARNm în tampon acetat la pH 4.0 cu un amestec de lipide, Hepato9 mRNA kit (nanosisteme de precizie), suspendat în etanol la un raport lipidic-medicament de ~11 (wt/wt). Animalele au fost injectate cu o singură doză intravenoasă de 1,5 mg/kg de ARNm formulat prin vena cozii. Animalele au fost sacrificate la 24 de ore după injectare, iar țesuturile au fost fixate și prelucrate pentru hibridizare in situ (ISH) și imunohistochimie (IHC).

colectarea probelor și pregătirea probelor FFPE. Animalele au fost necropsiate, iar lobul lateral stâng a fost plasat plat în casete de țesut (Fisher Scientific). Casetele au fost apoi plasate într-un recipient umplut cu formalină tamponată neutră 10%, soluție fixativă NBF (Sigma) la raportul minim 1:20 al volumului țesutului față de soluția fixativă. Probele au fost lăsate să se fixeze timp de minimum 24 de ore, dar nu mai mult de 48 de ore la temperatura camerei. După fixarea țesutului, caseta a fost plasată într-un recipient umplut cu PBS timp de cel mult 3 zile. După spălarea PBS, țesuturile hepatice au fost prelucrate și încorporate în blocuri de parafină.

2.4. Imunohistochimie și procedee de hibridizare in Situ

imunohistochimia pentru SERPINA1 s-a efectuat pe secțiuni de țesut cu parafină fixată cu formalină, 5 centimetrii, utilizând un anticorp la SERPINA1 (Atlas, HPA001292 la 1:100). Imunostimularea a fost efectuată pe platforma Leica BOND RX (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) conform protocoalelor standard cu controale pozitive adecvate. Recuperarea antigenului, standard pe platforma Leica BOND RX, a utilizat soluția Leica ER1, EDTA-Tris, pH 8.0. Diapozitivele au fost deshidratate într-o serie de etanol gradat, eliminate în xilen și montate folosind Citoseal. Diapozitivele au fost imaginate folosind sistemul VS120 la mărire de 40x (Olympus).

pentru vizualizarea ARNm s-a efectuat hibridizarea in situ (ISH). Sonda de hibridizare personalizată ARN in situ (Affymetrix, Santa Clara, CA) a fost concepută pentru a detecta ARNm SERPINA1. Analiza automată a ARN ISH a fost efectuată utilizând kitul de detectare ViewRNA eZ-l (Affymetrix, Santa Clara, CA) și platforma Leica BOND RX (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) a fost folosit. Țesuturile fixate cu formalină, încorporate cu parafină (FFPE) au fost preparate la grosimea de 5 um pe lamele de sticlă și puse pe legătura Leica RX. Testul ViewRNA eZ-l a fost efectuat conform protocolului manufactures, dar, pe scurt, ARN-ul a fost demascat cu o incubare de 10 minute la 95 de centi C în soluția de recuperare a Epitopului Bond 1 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL), urmată de incubarea de 20 de minute cu Proteinaza K din trusa de pretratare a enzimei Bond la diluția 1:1000 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Hibridizarea a fost efectuată cu diluarea sondei SERPINA1 1: 40 urmată de detectarea FastRed. Pentru a asigura integritatea ARN și procedura de testare, secțiuni suplimentare au fost, de asemenea, hibridizate cu o sondă pentru peptidil prolil izomeraza B (PPIB), o proteină endogenă de menaj utilizată ca control pozitiv pentru ISH. Pentru a controla colorarea nespecifică, sonda de control împotriva proteinei bacteriene dihidrodipicolinat reductază (dapB) a fost utilizată ca control negativ. Toate sondele au fost diluate la 1:40. Diapozitivele au fost uscate la aer, curățate în xilen și montate folosind Citoseal. Diapozitivele au fost imaginate folosind sistemul VS120 la mărire de 40x (Olympus).

3. Rezultate

3.1. expresia SERPINA1 umană derivată de ARNm în lizatele celulare și mediile celulare ale fibroblastelor pacientului și hepatocitele primare derivate din fibroblaste ale pacientului

ARNm SERPINA1 uman din TriLink a fost transfectat în fibroblaste ale pacientului AATD, obținut de la Institutul Coriell. Creșterea semnificativă a expresiei proteinei SERPINA1 umane a fost observată la lizații celulari (Figura 1(a)) și mediile de cultură celulară (Figura 1(b)) la transfecția Serpinei de tip sălbatic (WT) sau a serpinei cu marcaj (FT) 1.

(a)
(a)
(b)
(b)

(a)
(a)(b)
(b)

Figure 1
In vitro human SerpinA1 expression in cell lysates (a) and cell media (b) from AATD patient fibroblasts and normal skin fibroblasts. Vehicle control is GFP mRNA; WT-SERPINA1 is WT mRNA sequence; FT-SerpinA1 is flag-tagged mRNA sequence.

transfecția ARNm SERPINA1 umană a fost efectuată și la hepatocitele primare derivate din fibroblaste obținute din DefiniGen. Secreția proteinei WT SerpinA1 în mediul de cultură a fost crescută la 24 de ore comparativ cu controlul ARNm GFP al vehiculului. Am observat o creștere constantă a expresiei proteinei SerpinA1 în timp, așa cum se observă la 48H și 72h după transfecție (Figura 2).

Figure 2
In vitro human SerpinA1 expression in cell culture media obtained from patient fibroblast-derived hepatocytes (DefiniGen, Cambridge UK).

3.2. In Vivo Human SerpinA1 Expression in WT Mice

Human SerpinA1 protein expression was subsequently evaluated in WT C57bl/6 mice. ARNm SERPINA1 uman a fost observat în ficat (Figura 3 (a)) așa cum se poate aștepta, având în vedere că ARNm este încapsulat într-o nanoparticulă lipidică care, în general, livrează o cantitate mare din încărcătura sa către ficat. O constatare interesantă a fost că ARNm SERPINA1 a fost detectat și în plămânii șoarecilor (Figura 3(b)). Expresia proteinei SerpinA1 a fost detectată folosind un anticorp SerpinA1 specific uman. Proteina SerpinA1 a fost observată atât în ficat (Figura 3 (c)), cât și în plămâni(Figura 3 (d)). Modelul de distribuție sinusoidală a expresiei proteinei SerpinA1 în ficat indică faptul că proteina SerpinA1 este probabil secretată în sânge de hepatocite.

(b)

(c)(string)

div>

(d)(d)

(a)
(a)(b)
(B)(redet)
(d)
(d)
in vivo SERPINA1 ARNm biddistribution în ficat(a) și plămâni(B) de WT mippa 24h după I.v. a fost detoxedted opus ish. Punctele roșii din imagine reprezintă ARNm. Proteina SerpinA1 a fost vizualizată în ficat (c) și plămâni (d) de către IHC.

4. Discuție

AATD este o boală devastatoare, cu o nevoie de terapii eficiente în beneficiul pacienților. Terapia actuală de augmentare este inadecvată pentru a evita deteriorarea pe termen lung a ficatului pacienților cu AATD. În prezent, multe grupuri urmăresc modalități noi de a oferi terapii atât de necesare, cum ar fi terapia genică. De exemplu, transplantul de celule stem derivate din măduva osoasă a fost testat la șoareci AATD și a demonstrat o oarecare salvare a deteriorării hepatocitelor . Strategiile de înlocuire a genelor sunt , de asemenea, testate în clinică, în care o genă WT SERPINA1 este inserată în ficat și exprimă proteina SerpinA1 adecvată. Metodele actuale trebuie încă optimizate și livrarea de gene mediată de AAV poate determina scăderea mediată de anticorpi a secreției de proteine sau o reacție imunologică la capsida virală.

am evaluat efectul expresiei tranzitorii a ARNm SERPINA1 în ficatul de șoarece, deoarece livrarea ARNm în ficat este relativ simplă și stabilită prin nanoparticule lipidice (LNP) și putem administra ARNm încapsulat LNP fără reacții imune semnificative. Inițial am testat ipoteza noastră în fibroblaste pacient AATD și hepatocite primare derivate din fibroblaste pacient. Datele noastre demonstrează clar că putem codifica SERPINA1 cu ARNm și ulterior exprimăm proteina SerpinA1 din ambele tipuri de celule. De asemenea, demonstrăm că proteina SerpinA1 este secretată din aceste celule, iar nivelurile de proteine pot fi măsurate în mediul de cultură supernatant/celular. Aceasta implică faptul că proteina SerpinA1 codificată cu ARNm este pliată și modificată corespunzător în interiorul celulei pentru a permite secreția din ER și în mediul de cultură celulară, care este o caracteristică cheie a acestei terapii cu ARNm. Folosind terapia cu ARNm, putem folosi propriile celule ale corpului ca o fabrică pentru a sintetiza proteinele, a le modifica posttranslațional și, în cele din urmă, a le secreta în fluxul sanguin. Analiza preliminară a mediului de cultură celulară indică faptul că serpina secretată1 este activă enzimatic într-un test de inhibare a elastazei neutrofile (datele nu sunt prezentate). Datele noastre din figurile 1, 2 și 3 sugerează că nivelurile de proteină SerpinA1 sunt semnificativ mai mari decât nivelurile inițiale sau nivelurile de control negative. Aceste niveluri ar trebui să fie suficiente pentru a reduce activitatea elastazei neutrofile în plasmă și plămâni și, prin urmare, pentru a preveni degradarea alveolară și emfizemul, care sunt caracteristice AATD.

ne-am extins studiile pentru a determina dacă serpina codificată arnm1 ar putea fi exprimată in vivo. Studiile noastre demonstrează că ARNm SERPINA1 uman injectat intravenos a atins atât ficatul, cât și plămânii la șoarecii WT (figurile 3(a) și 3(b)). Astfel, terapia ARNm încapsulată cu lipide ar putea viza ambele site-uri ale AATD (ficat și plămân). Mai important, proteina SERPINA1 umană a fost produsă atât în ficat, cât și în plămânii șoarecilor WT (figurile 3(c) și 3(d)). Modelul de expresie a proteinei SerpinA1 din sinusoidele hepatice indică faptul că proteinele sunt secretate de hepatocite sau de un alt tip de celule hepatice, cum ar fi celulele stelate care exprimă în mod normal SERPINA1. Datele noastre nu pot exclude posibilitatea ca ARNm să intre sau să fie exprimat de alte celule hepatice în afară de hepatocite, iar acest lucru va necesita lucrări suplimentare. Este posibil ca proteina SERPINA1 umană din plămâni să provină din două surse: ARNm SERPINA1 care a ajuns la plămâni prin injecție i.v., precum și SERPINA1 uman secretat produs de ARNm SERPINA1 uman în ficat. În ambele cazuri, potențialul de exprimare și localizare a proteinei SerpinA1 în plămâni și ficat este promițător, deoarece ar putea bloca leziunile mediate de elastaza neutrofilă în plămâni, în timp ce este posibil să scadă formele PIZZ în ficat. Această din urmă ipoteză se bazează pe studiile lui Karadagi și colab. în care o creștere a proteinei SerpinA1 prin terapia de augmentare a demonstrat o scădere a formei PIZZ la pacientul aatd pbmc. Acest lucru ridică posibilitatea ca proteina SerpinA1 codificată de ARNm, atunci când este exprimată în ficat, să scadă producția hepatică a formei PIZZ și ulterior să inhibe fibroza hepatică. Inhibarea fibrozei hepatice și a stresului ER ar putea reduce/elimina în cele din urmă nevoia pacientului AATD pentru un transplant de ficat. Ipoteza noastră trebuie testată in vivo într-un model AATD care demonstrează fibroza hepatică și progresia spre carcinomul hepatocelular.

deși acestea sunt date interesante, am dori să subliniem că Terapiile ARNm trebuie îmbunătățite pentru a oferi potențial beneficii cronice pacienților cu AATD. Timpul de înjumătățire actual pentru ARNm eliberat exogen este de obicei 24-48h în țesut, în timp ce timpul de înjumătățire al proteinelor variază în funcție de proteină și de mecanismele sale degradative. Strategiile de creștere a timpului de înjumătățire a ARNm sunt în prezent în curs de investigare, iar datele timpurii indică faptul că putem crește durata stabilității ARNm prin modularea UTR-urilor care flancează ARNm optimizat pentru codoni . Strategiile raționale de Inginerie a proteinelor sunt, de asemenea, vizate pentru a facilita creșterea timpului de înjumătățire a proteinelor, ceea ce duce la creșterea activității enzimatice și, în cele din urmă, la scăderea nevoii de dozare a terapiei cu ARNm . Aceste îmbunătățiri noi ar putea duce la o terapie cu ARNm care este dozată rar și menține suficientă activitate enzimatică, de exemplu, a proteinei SerpinA1, pentru a oferi îmbunătățiri clinice. Un alt aspect care ar îmbunătăți terapiile ARNm este siguranța livrării LNP prin care putem doza LNP la fiecare câteva săptămâni. Tehnologia actuală LNP facilitează un regim de dozare o dată pe lună, dar nu acceptă o dozare mai frecventă dacă asociem dozarea cu eficacitatea. Așa cum am menționat mai devreme, terapiile ARNm încapsulate cu LNP pot fi redosate, spre deosebire de unele terapii cu gene AAV, iar doza poate fi titrată pentru a oferi beneficii maxime pacientului.

5. Concluzie

studiile noastre prezintă potențialul unei noi modalități terapeutice, terapia ARNm, prin care o proteină lipsă sau nefuncțională poate fi înlocuită pentru a îndeplini funcții normale. Descoperirile noastre demonstrează că ARNm încapsulat cu lipide poate fi direcționat către plămâni și ficat, care sunt cele două site-uri principale ale bolii în AATD. În timp ce studiile anterioare care au explorat terapia cu ARNm pentru AATD au arătat expresia proteinelor la 24 de ore în celulele a549 și HEK293 , studiile noastre demonstrează expresia proteinei SerpinA1 la fibroblastele pacienților cu aatd și hepatocitele derivate din pacient, care sunt linii celulare relevante pentru boală. În plus, extindem studiile anterioare în acest domeniu demonstrând că ARNm încapsulat cu lipide poate livra la ficatul și plămânii șoarecilor și produce proteina SerpinA1 pentru a fi relevantă din punct de vedere funcțional pentru pacienți. Trebuie efectuate cercetări suplimentare într-un model de boală AATD și pentru a asigura siguranța dozării multiple a ARNm la rozătoare și animale superioare înainte de a lua în considerare această modalitate de uz uman. Luate împreună, studiile noastre ridică posibilitatea interesantă ca terapia cu ARNm care utilizează ARNm SERPINA1 să fie benefică pentru pacienții cu AATD.

disponibilitatea datelor

toate datele care susțin rezultatele publicate în acest articol sunt prezentate în articol. Nu există alte date disponibile.

conflicte de interese

toți autorii sunt angajați și acționari ai Alexion Pharmaceuticals, Inc., o companie care dezvoltă terapii pentru boli rare și ultrare.

contribuțiile autorilor

Brendan Connolly a proiectat și realizat culturi celulare, transfecții și prelucrare in vivo a probelor. Cleo Isaacs proiectat și realizat IHC. Lei Cheng a proiectat și a efectuat experimente ISH, scriere manuscrisă și studii in vivo. Kirtika H. Asrani a efectuat bloturi occidentale, teste imunologice și procesare in vivo a probelor. Romesh R. Subramanian a proiectat experimente, a analizat date și a scris manuscris

mulțumiri

Alexion Pharmaceuticals, Inc., este recunoscut pentru finanțare.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.