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SERPINA1 mRNA come trattamento per la carenza di alfa-1 antitripsina

Abstract

La carenza di alfa-1-antitripsina (AAT) è una malattia genetica che produce AAT inattivo / difettoso a causa di mutazioni nel gene SERPINA1 che codifica per AAT. Questa malattia è associata a una diminuzione dell’attività di AAT nei polmoni e alla deposizione di un’eccessiva proteina AAT difettosa nel fegato. Attualmente non esiste un trattamento specifico per la malattia del fegato associata a carenza di AAT. La malattia polmonare AAT viene spesso trattata con uno dei numerosi prodotti sostitutivi delle proteine del siero; tuttavia, non sono disponibili studi a lungo termine sull’efficacia della terapia sostitutiva SerpinA1 e non riduce il danno epatico nella carenza di AAT. La terapia con mRNA potrebbe potenzialmente colpire sia il fegato che i polmoni dei pazienti con deficit di AAT. I fibroblasti del paziente AAT e gli epatociti derivati dai fibroblasti del paziente AAT sono stati trasfettati con mRNA codificante SERPINA1 e i mezzi di coltura cellulare sono stati testati per l’espressione di SerpinA1. I nostri dati dimostrano un aumento della proteina SerpinA1 nei terreni di coltura dai fibroblasti del paziente AAT trattati e dagli epatociti derivati dai fibroblasti del paziente AAT. Studi in vivo su topi wild type dimostrano la biodistribuzione dell’mRNA SERPINA1 nel fegato e nei polmoni, così come l’espressione della proteina SerpinA1 in questi due organi bersaglio che sono criticamente colpiti dalla carenza di AAT. Presi insieme, i nostri dati suggeriscono che la terapia con mRNA SerpinA1 ha il potenziale per avvantaggiare i pazienti affetti da carenza di AAT.

1. Introduzione

La carenza di alfa-1-antitripsina (AATD) è una malattia devastante con una mancanza di terapie adeguate. Le terapie attuali proteggono solo i polmoni e nei casi avanzati richiedono frequenti iniezioni endovenose di proteine AAT derivate dal plasma. I pazienti con AATD sono predisposti alla broncopneumopatia ostruttiva e alla malattia epatica (ad es. cirrosi e carcinoma epatocellulare nei bambini e negli adulti) . Si stima che circa l ‘ 1-5% dei pazienti con malattia polmonare ostruttiva cronica diagnosticata (BPCO) abbia deficit di alfa-1-antitripsina . Mentre estremamente raro, enfisema in bambini con AATD è stato riferito e l’incidenza della malattia del fegato aumenta con l’età . I sintomi gravi si verificano più tardi nella vita, in particolare nei fumatori. I sintomi epatici di AATD sono veduti in ritardo nella vita e spesso richiedono il trapianto del fegato. AATD è una malattia ereditaria causata da mutazioni all’interno del gene SERPINA1 . Il gene SERPINA1 ha due alleli designati come alleli M (i pazienti normali hanno un genotipo MM). L’allele più comune con conseguente grave carenza di AAT è chiamato Z (E342K) . È stato riportato che il 95% dei pazienti AATD gravi ha un genotipo di Serp e ha solo il 10-20% dei livelli sierici di SerpinA1 . Nei casi di mutazione Z la proteina SerpinA1 non può ripiegarsi correttamente e non sarà secreta dagli epatociti; pertanto l’AATD non è causata dall’incapacità di produrre proteine ma dall’incapacità di secernere proteine funzionali. L’accumulo di Serp SerpinA1 negli epatociti provoca gravi danni al fegato . Il PIZZ omozigote è abbastanza comune e si verifica in 1:2500-3000 nascite in Nord America e in Europa.

Alfa-1-antitripsina (AAT), noto anche come SERPINA1 (inibitore della serina proteasi, gruppo A, membro 1), è una proteina secreta prodotta principalmente da epatociti e in misura minore da fagociti mononucleati, neutrofili e cellule epiteliali delle vie aeree/intestinali . SerpinA1 è una glicoproteina circolante che è anche solubile in acqua e diffusibile nei tessuti . Il ruolo primario di SerpinA1 è la regolazione della serina proteasi e il sito principale di questa azione è nei polmoni. Lì, SerpinA1 lega e inattiva l’elastasi neutrofila proteggendo così i tessuti alveolari dalla degradazione proteolitica durante le risposte infiammatorie . SerpinA1 è l’anti-proteasi circolante più abbondante e le normali concentrazioni plasmatiche di SerpinA1 raggiungono solitamente 1-2 g / L .

AATD è caratterizzato da polimerizzazione delle proteine SerpinA1 misfolded nel reticolo endoplasmatico ruvido degli epatociti che diminuisce la concentrazione e l’attività di SerpinA1 nel sangue e nei tessuti . Per i pazienti con grave deficit, i livelli sierici di SerpinA1 sono inferiori a 50 mg / dL mentre i livelli normali sono a 200 mg / dL. Con bassi livelli di SerpinA1 circolante, i polmoni non sono protetti dall’elastasi neutrofila, un enzima che distrugge gli alveoli e causa malattie polmonari. Pertanto, le complicanze cliniche più frequenti di AATD sono l’enfisema polmonare e la malattia del fegato .

Ad oggi solo la terapia di aumento AAT è disponibile per il trattamento di AATD. La terapia di aumento di AAT è stata sviluppata nel 1987 ed è attualmente approvata soltanto per uso commerciale in pazienti selezionati con enfisema polmonare riferito AATD severo . L’aumento AAT aiuta solo a fornire SerpinA1 ai polmoni dove può aiutare a prevenire il danno da elastasi neutrofila. Poiché la carenza sierica non è la causa di danni al fegato, non esiste un trattamento specifico per i pazienti affetti da malattia epatica associata a AATD. L’unico trattamento è la terapia di supporto per l’insufficienza epatica tipica e il trapianto di fegato per i pazienti con cirrosi scompensata .

L’AATD è un disturbo monogenico che lo rende un bersaglio ideale per la terapia con mRNA. L’mRNA è una nuova modalità che è potenzialmente applicabile per una vasta gamma di malattie a causa della sua enorme flessibilità rispetto alle tradizionali terapie sostitutive biologiche ed enzimatiche. Le terapie basate su mRNA utilizzano il macchinario endogeno della cellula ospite per la produzione e la modificazione posttranslazionale delle proteine bersaglio, consentendo lo sviluppo di terapie per malattie non precedentemente targetable. Abbiamo condotto studi in vitro e in vivo per determinare se potevamo esprimere SerpinA1 codificato esogenamente e indirizzare l’mRNA/proteina all’organo appropriato.

La terapia con mRNA potrebbe potenzialmente colpire sia il fegato che i polmoni di pazienti con deficit di AAT (in attesa degli esperimenti in corso). I nostri dati hanno dimostrato un aumento della proteina SerpinA1 nei terreni di coltura cellulare dei fibroblasti dei pazienti AAT trattati, nonché nei terreni di coltura cellulare degli epatociti primari derivati dai fibroblasti dei pazienti AAT. Inoltre, negli animali WT che ricevevano l’mRNA SERPINA1 tramite iniezione endovenosa, sia l’mRNA SERPINA1 che la proteina SerpinA1 sono stati osservati localizzati sia nel fegato che nei polmoni. Presi insieme, i nostri dati suggeriscono che l’espressione mediata da mRNA della proteina SerpinA1 nel polmone potrebbe inibire l’elastasi dei neutrofili, mentre potrebbe promuovere l’espressione dell’isoforma MM nel fegato e fornire molteplici vie di beneficio per i pazienti AAT.

2. Materiali e metodi

2.1. Fibroblasti pazienti AATD

Condizioni di coltura cellulare. I seguenti fibroblasti del paziente sono stati ottenuti dall’Istituto Coriell per la ricerca medica, Cell Repository (Camden, NJ) : GM11423 e GM12445 dal fegato paziente di AATD e GM02522 dalla pelle paziente di AATD e dalla linea normale ND34769 del fibroblasto di controllo dalla pelle. Le cellule sono state coltivate nel mezzo minimo essenziale di Eagle con sali di Earle e aminoacidi non essenziali (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) integrato con siero bovino fetale al 15% e incubato a 37°C in 5% di CO2.

Condizioni di trasfezione. I fibroblasti dei pazienti sono stati trasfettati con 2.5ug di ogni mRNA e 4 µl di mRNA-In reagente di trasfezione lipidica (MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD), in 3 esperimenti indipendenti con 3 repliche biologiche per esperimento. Ogni mRNA è stato diluito a 2,5 µg in OptiMEM (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) e allo stesso modo il volume appropriato di mRNA – In è stato diluito in OptiMEM per pozzo e il protocollo è stato seguito secondo la raccomandazione del produttore. L’mRNA diluito è stato miscelato con lipidi diluiti e lasciato incubare per 15 minuti a temperatura ambiente prima di aggiungerlo alle cellule. Dopo l’aggiunta della miscela mRNA-lipid ai fibroblasti del paziente, le cellule sono state restituite all’incubatore a 37°C con il 5% di CO2. Dopo 24 ore le cellule sono state lavate delicatamente con PBS due volte e lisate in tampone RIPA fresco (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) con inibitori della proteasi 1X (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Lisi cellulare e quantificazione totale delle proteine: I lisati delle cellule dei fibroblasti del paziente sono stati raccolti in provette da 0,5 ml (Eppendorf, Amburgo, Germania) e centrifugati a 18000 x g a 4°C per rimuovere i detriti cellulari. Dopo la centrifugazione, il surnatante trasparente è stato accuratamente trasferito in un tubo etichettato separato e posto sul ghiaccio. La concentrazione totale di proteine è stata determinata con BCA assay kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) in duplicato in formato 96-well secondo il protocollo del produttore.

Elettroforesi capillare automatizzata Wes per l’espressione di SERPINA1. I campioni finali di 5 µl ciascuno a 0,4 mg/ml di concentrazione proteica sono stati preparati seguendo le istruzioni del produttore di Protein Simple Wes. I lisati sono stati analizzati utilizzando il sistema di elettroforesi capillare Protein Simple Wes (ProteinSimple Wes; ProteinSimple, San Jose, CA). Le proteine separate dalle dimensioni sono state sondate con anticorpi specifici per SERPINA1 a diluizione 1:125 (Novus NBP1-90309, Novus Biologics, Littleton, CO) e la governante tioredossina a 1: 1000 (CST 2429, Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), visualizzati utilizzando anticorpi secondari coniglio etichettati e quantificati utilizzando il software dei produttori. Per ogni corsia, l’area sotto la curva (AUC) della SERPINA1 è stata normalizzata all’AUC del controllo della tioredossina.

2.2. Epatociti con deficit di antitripsina alfa-1

Condizioni di coltura cellulare. Gli epatociti derivati dal paziente AATD sono stati generati da fibroblasti AATD da DefiniGen (Cambridge UK) utilizzando un protocollo di differenziazione proprietario. Le cellule sono state coltivate in supporti DTM e supporti DRM (DefiniGen, Cambridge UK) e placcate a 500.000 cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Le cellule sono state coltivate in condizioni ipossiche a 37°C in 5% CO2 e 5% O2 con il supporto che viene cambiato ogni due giorni per 10 giorni prima della trasfezione in base al protocollo del produttore proprietario (DefiniGen, Cambridge UK). Le cellule sono state coltivate in condizioni ipossiche secondo le istruzioni del produttore, che hanno permesso la crescita cellulare, mentre le condizioni non ipossiche hanno ridotto la crescita cellulare.

Condizioni di trasfezione ed espressione proteica mediante ELISA. Gli epatociti AATD sono stati trasfettati con 4ul di Lipofectamine® 2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) per 2.5ug mRNA, in 3 esperimenti indipendenti con 3 repliche biologiche per esperimento. Le cellule sono state quindi incubate per 24, 48 e 72 ore prima che i mezzi di coltura cellulare venissero rimossi e analizzati per la concentrazione di proteine SerpinA1 utilizzando un ELISA di Abcam (Cambridge, MA) e seguendo il protocollo del produttore.

2.3. Studi in Vivo

Tutti gli esperimenti, l’alloggiamento degli animali, la manipolazione e le procedure/protocolli sperimentali sono stati approvati ed eseguiti in conformità con Alexion Pharmaceuticals Inc. Linee guida e regolamenti IACUC. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6 (di 6 settimane). I topi sono stati tenuti in un ambiente a temperatura controllata con un ciclo chiaro-scuro 12-h/12-h, con una dieta standard e acqua ad libitum.

Formulazione di mRNA in nanoparticelle lipidiche e dosaggio in vivo. I costrutti di mRNA sono stati formulati utilizzando una nanoparticella lipidica ionizzabile autoassemblante (LNP) contenente mRNA SERPINA1. Un mRNA di codifica GFP è stato utilizzato come controllo del veicolo caricato da mRNA e il PBS è stato utilizzato come controllo negativo in questo esperimento. Gli LNP sono stati preparati mediante miscelazione rapida di mRNA in tampone di acetato a pH 4.0 con una miscela lipidica, Hepato9 mRNA kit (NanoSistemi di precisione), sospeso in etanolo ad un rapporto lipido-farmaco di ~11 (wt/wt). Agli animali è stata iniettata una singola dose endovenosa di 1,5 mg/kg di mRNA formulato attraverso la vena della coda. Gli animali sono stati sacrificati 24 ore dopo l’iniezione e i tessuti sono stati fissati e trattati per ibridazione in situ (ISH) e immunoistochimica (IHC).

Raccolta del campione e preparazione del campione FFPE. Gli animali sono stati necrotizzati e il lobo laterale sinistro è stato posizionato in cassette di tessuto (Fisher Scientific). Le cassette sono state quindi collocate in un contenitore riempito con formalina tamponata neutra al 10%, soluzione fissativa NBF (Sigma) con un rapporto minimo di 1:20 tra volume tissutale e soluzione fissativa. I campioni sono stati autorizzati a fissare per un minimo di 24h ma non più di 48h a temperatura ambiente. Dopo il fissaggio del tessuto, la cassetta è stata posta in un contenitore riempito con PBS per non più di 3 giorni. Dopo il lavaggio PBS, i tessuti epatici sono stati elaborati e incorporati in blocchi di paraffina.

2.4. Immunoistochimica e procedure di ibridazione in Situ

L’immunoistochimica per SERPINA1 è stata eseguita su sezioni di tessuto 5 µm incorporate in paraffina con formalina, utilizzando un anticorpo per SERPINA1 (Atlas, HPA001292 a 1:100). L’immunocolorazione è stata eseguita sulla piattaforma Leica BOND RX (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) secondo protocolli standard con opportuni controlli positivi. Il recupero dell’antigene, standard sulla piattaforma Leica BOND RX, ha utilizzato la soluzione Leica ER1, EDTA-Tris, pH 8.0. I vetrini sono stati disidratati in una serie di etanolo graduato, eliminati in xilene e montati utilizzando Citoseal. Le diapositive sono state riprese utilizzando il sistema VS120 con ingrandimento 40x (Olympus).

Per la visualizzazione dell’mRNA, è stata eseguita l’ibridazione in situ (ISH). Custom RNA in situ hybridization probe (Affymetrix, Santa Clara, CA) è stato progettato per rilevare l’mRNA SERPINA1. Il test automatizzato di RNA ISH è stato eseguito utilizzando il kit di rilevamento ViewRNA eZ-L (Affymetrix, Santa Clara, CA) e la piattaforma Leica BOND RX (Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL) è stato utilizzato. I tessuti fissati in formalina e incorporati in paraffina (FFPE) sono stati preparati con uno spessore di 5 um su vetrini e applicati al Leica BOND RX. Il test ViewRNA eZ-L è stato eseguito secondo il protocollo manufactures ma, brevemente, l’RNA è stato smascherato con un’incubazione di 10 minuti a 95°C nella soluzione di recupero dell’epitopo di Bond 1 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL), seguita da un’incubazione di 20 minuti con Proteinasi K dal kit di pretrattamento dell’enzima Bond a diluizione 1:1000 (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). L’ibridazione è stata eseguita con la diluizione della sonda SERPINA1 1:40 seguita dalla rilevazione FastRed. Per garantire l’integrità dell’RNA e la procedura di analisi, sezioni aggiuntive sono state ibridate con una sonda per peptidil prolil isomerasi B (PPIB), una proteina di pulizia endogena utilizzata come controllo positivo per ISH. Per controllare la colorazione aspecifica, la sonda di controllo contro la proteina batterica diidrodipicolinato reduttasi (dapB) è stata utilizzata come controllo negativo. Tutte le sonde erano a una diluizione 1: 40. I vetrini sono stati essiccati all’aria, ripuliti con xilene e montati con Citoseal. Le diapositive sono state riprese utilizzando il sistema VS120 con ingrandimento 40x (Olympus).

3. Risultati

3.1. Espressione di SerpinA1 umana derivata da mRNA nei lisati cellulari e nei media cellulari dei fibroblasti del paziente e degli epatociti primari derivati dai fibroblasti del paziente

SERPINA1 umano L’mRNA di TriLink è stato trasfettato in fibroblasti del paziente AATD, ottenuti dall’Istituto Coriell. Un aumento significativo dell’espressione della proteina SerpinA1 umana è stato osservato nei lisati cellulari (Figura 1(a)) e nei terreni di coltura cellulare (Figura 1(b)) dopo trasfezione di SerpinA1 wild type (WT) o FLAG-tagged (FT).

(a)
(a)
(b)
(b)

(a)
(a)(b)
(b)

Figure 1
In vitro human SerpinA1 expression in cell lysates (a) and cell media (b) from AATD patient fibroblasts and normal skin fibroblasts. Vehicle control is GFP mRNA; WT-SERPINA1 is WT mRNA sequence; FT-SerpinA1 is flag-tagged mRNA sequence.

La trasfezione di mRNA SERPINA1 umano è stata effettuata anche in epatociti primari derivati dai fibroblasti ottenuti da DefiniGen. La secrezione della proteina WT SerpinA1 nel mezzo di coltura è stata aumentata a 24h rispetto al controllo del solo mRNA GFP del veicolo. Abbiamo osservato un costante aumento dell’espressione della proteina SerpinA1 nel tempo come visto a 48h e 72h dopo la trasfezione (Figura 2).

Figure 2
In vitro human SerpinA1 expression in cell culture media obtained from patient fibroblast-derived hepatocytes (DefiniGen, Cambridge UK).

3.2. In Vivo Human SerpinA1 Expression in WT Mice

Human SerpinA1 protein expression was subsequently evaluated in WT C57bl/6 mice. L’mRNA SERPINA1 umano è stato osservato nel fegato(Figura 3 (a)) come ci si può aspettare dato che l’mRNA è incapsulato in una nanoparticella lipidica che generalmente trasporta una grande quantità del suo carico al fegato. Una scoperta interessante è stata che l’mRNA SERPINA1 è stato rilevato anche nei polmoni dei topi (Figura 3(b)). L’espressione della proteina SerpinA1 è stata rilevata utilizzando un anticorpo SerpinA1 specifico umano. La proteina SerpinA1 è stata osservata sia nel fegato(Figura 3 (c)) che nei polmoni (Figura 3(d)). Il modello di distribuzione sinusoidale dell’espressione della proteina SerpinA1 nel fegato indica che la proteina SerpinA1 viene probabilmente secreta nel sangue dagli epatociti.

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umani in vivo serpina1 mrna biddistribution nel fegato(a) e i polmoni(b) di wt mippa 24 ore dopo l’ho.v. era detoxedted di fronte ISH. I punti rossi nell’immagine rappresentano l’mRNA. La proteina SerpinA1 è stata visualizzata nel fegato (c) e nei polmoni (d) da IHC.

4. Discussione

L’AATD è una malattia devastante con la necessità di terapie efficaci a beneficio dei pazienti. L’attuale terapia di aumento è inadeguata per evitare danni a lungo termine al fegato dei pazienti con AATD. Attualmente molti gruppi stanno perseguendo nuove modalità per fornire terapie tanto necessarie come la terapia genica. Ad esempio, il trapianto di cellule staminali derivate dal midollo osseo è stato testato su topi AATD e ha dimostrato un certo salvataggio del deterioramento degli epatociti . Strategie di sostituzione del gene sono anche in fase di test in clinica, in cui un gene SERPINA1 WT viene inserito nel fegato ed esprime la proteina SerpinA1 appropriata. I metodi attuali devono ancora essere ottimizzati e la consegna genica mediata da AAV può causare una diminuzione mediata da anticorpi nella secrezione proteica o una reazione immunologica al capside virale.

Abbiamo valutato l’effetto dell’espressione transitoria dell’mRNA SERPINA1 nel fegato di topo poiché la consegna dell’mRNA al fegato è relativamente semplice e stabilita tramite nanoparticelle lipidiche (LNP) e possiamo somministrare mRNA incapsulato con LNP senza reazioni immunitarie significative. Inizialmente abbiamo testato la nostra ipotesi nei fibroblasti del paziente AATD e negli epatociti primari derivati dai fibroblasti del paziente. I nostri dati dimostrano chiaramente che possiamo codificare SERPINA1 con mRNA e successivamente esprimere la proteina SerpinA1 da entrambi i tipi di cellule. Dimostriamo anche che la proteina SerpinA1 è secreta da queste cellule e che i livelli di proteine possono essere misurati nel mezzo di coltura surnatante / cellulare. Ciò implica che la proteina SerpinA1 codificata con mRNA viene piegata e modificata in modo appropriato all’interno della cellula per consentire la secrezione dal pronto soccorso e nel mezzo di coltura cellulare, che è una caratteristica chiave di questa terapia con mRNA. Utilizzando la terapia mRNA, possiamo utilizzare le cellule del corpo come una fabbrica per sintetizzare proteine, modificarlo posttranslazionalmente e infine secernerlo nel flusso sanguigno. L’analisi preliminare del mezzo di coltura cellulare indica che il SerpinA1 secreto è enzimaticamente attivo in un test di inibizione dell’elastasi neutrofila (dati non mostrati). I nostri dati nelle figure 1, 2 e 3 suggeriscono che i livelli di proteina SerpinA1 sono significativamente più alti dei livelli di controllo basali o negativi. Questi livelli dovrebbero essere sufficienti per diminuire l’attività dell’elastasi neutrofila nel plasma e nei polmoni e quindi prevenire la degradazione alveolare e l’enfisema, che sono caratteristici dell’AATD.

Abbiamo esteso i nostri studi per determinare se SERPINA1 codificato con mRNA potesse essere espresso in vivo. I nostri studi dimostrano che l’mRNA SERPINA1 umano iniettato per via endovenosa ha raggiunto sia il fegato che i polmoni nei topi WT (Figure 3(a) e 3(b)). Pertanto, la terapia con mRNA incapsulato lipidico potrebbe potenzialmente colpire entrambi i siti di AATD (fegato e polmone). Ancora più importante, la proteina SerpinA1 umana è stata prodotta sia nel fegato che nei polmoni dei topi WT (Figure 3(c) e 3(d)). Il modello di espressione della proteina SerpinA1 nei sinusoidi epatici indica che le proteine vengono secrete dagli epatociti o da un altro tipo di cellule epatiche come le cellule stellate che normalmente esprimono SERPINA1. I nostri dati non possono escludere la possibilità che l’mRNA entri o sia espresso da altre cellule epatiche oltre agli epatociti, e questo richiederà ulteriori lavori. È possibile che la proteina umana SerpinA1 nei polmoni provenga da due fonti: l’mRNA SERPINA1 che ha raggiunto i polmoni tramite iniezione endovenosa, così come il SerpinA1 umano secreto prodotto dall’mRNA SERPINA1 umano nel fegato. In entrambi i casi, il potenziale per l’espressione e la localizzazione della proteina SerpinA1 nei polmoni e nel fegato è promettente in quanto potrebbe bloccare il danno mediato dai neutrofili elastasi nei polmoni mentre possibilmente diminuendo le forme di PIZZ nel fegato. Quest’ultima ipotesi si basa sugli studi di Karadagi et al. in cui un aumento della proteina SerpinA1 mediante terapia di aumento ha dimostrato una diminuzione della forma PIZZ in AATD paziente PBMC. Ciò solleva la possibilità che la proteina SerpinA1 codificata con mRNA, quando espressa nel fegato, possa diminuire la produzione epatica della forma PIZZ e successivamente inibire la fibrosi epatica. L’inibizione della fibrosi epatica e lo stress ER potrebbe infine ridurre / eliminare la necessità del paziente AATD per un trapianto di fegato. La nostra ipotesi deve essere testata in vivo in un modello AATD che dimostri la fibrosi epatica e la progressione al carcinoma epatocellulare.

Mentre questi sono dati eccitanti, vorremmo sottolineare che le terapie mRNA devono essere migliorate per fornire potenzialmente benefici cronici per i pazienti con AATD. Le emivite correnti per mRNA esogeno consegnato sono tipicamente 24-48h in tessuto, mentre le emivite della proteina variano secondo la proteina ed i suoi meccanismi degradativi. Le strategie per aumentare l’emivita degli MRNA sono attualmente in fase di studio e i primi dati indicano che possiamo aumentare la durata della stabilità dell’mRNA modulando gli UTR che affiancano l’mRNA ottimizzato per codone . Le strategie di ingegneria delle proteine razionali sono anche mirate a facilitare l’aumento dell’emivita proteica che si traduce in un aumento dell’attività enzimatica e, infine, in una diminuzione della necessità di dosaggio della terapia mRNA . Questi nuovi miglioramenti potrebbero portare a una terapia con mRNA che viene dosata raramente e mantiene un’attività enzimatica sufficiente, ad esempio, della proteina SerpinA1, per fornire un miglioramento clinico. Un altro aspetto che migliorerebbe le terapie mRNA è la sicurezza della consegna LNP per cui possiamo dosare LNPs ogni poche settimane. L’attuale tecnologia LNP facilita un regime di dosaggio una volta al mese, ma non supporta un dosaggio più frequente se accoppiamo il dosaggio con l’efficacia. Come accennato in precedenza, le terapie mRNA incapsulate con LNP possono essere ridosate, a differenza di alcune terapie geniche AAV, e la dose può essere titolata per fornire il massimo beneficio per il paziente.

5. Conclusione

I nostri studi presentano il potenziale di una nuova modalità terapeutica, la terapia mRNA, per cui una proteina mancante o non funzionale può essere sostituita per svolgere funzioni normali. I nostri risultati dimostrano che l’mRNA incapsulato in lipidi può essere mirato al polmone e al fegato, che sono i due siti primari di malattia in AATD. Mentre gli studi precedenti che esplorano la terapia del mRNA per AATD hanno indicato l’espressione della proteina a 24h in cellule A549 e HEK293 , i nostri studi dimostrano l’espressione della proteina SerpinA1 nei fibroblasti del paziente di AATD e negli epatociti paziente-derivati che sono linee cellulari pertinenti per la malattia. Inoltre, estendiamo studi precedenti in questo campo dimostrando che l’mRNA incapsulato in lipidi può fornire al fegato e ai polmoni del topo e produrre la proteina SerpinA1 per essere funzionalmente rilevante per i pazienti. Ulteriori ricerche devono essere condotte in un modello di malattia AATD e per garantire la sicurezza del dosaggio multiplo di mRNA nei roditori e negli animali superiori prima di considerare questa modalità per uso umano. Presi insieme, i nostri studi sollevano l’interessante possibilità che la terapia con mRNA che utilizza l’mRNA SERPINA1 possa essere utile per i pazienti con AATD.

Disponibilità dei dati

Tutti i dati a supporto dei risultati pubblicati in questo articolo sono presentati nell’articolo. Non ci sono altri dati disponibili.

Conflitti di interesse

Tutti gli autori sono dipendenti e azionisti di Alexion Pharmaceuticals, Inc., una società che sviluppa terapie per malattie rare e ultrarare.

Contributi degli autori

Brendan Connolly ha progettato e realizzato colture cellulari, trasfezioni ed elaborazione di campioni in vivo. Cleo Isaacs progettato e realizzato IHC. Lei Cheng ha progettato e realizzato esperimenti ISH, scrittura manoscritta e studi in vivo. Kirtika H. Asrani ha eseguito western blot, test immunologici ed elaborazione di campioni in vivo. Romesh R. Subramanian ha progettato esperimenti, esaminato i dati e ha scritto manoscritti

Riconoscimenti

Alexion Pharmaceuticals, Inc., è riconosciuto per finanziamento.

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