Articles

FIXATION

BOT/MICRO/ZOO 5364

PREPARATION OF BIOLOGICAL SPECIMENS

FIXATION

Fixation of tissues is the most crucial step in thepreparation of tissue for observation in the transmission electron microscope. Fixation consists of two steps: upphörande av normala livsfunktioner ivävnad(dödande) och stabilisering av vävnadsstrukturen (bevarande). Målet med fixering är att bevara strukturen så troget sommöjligt jämfört med levande tillstånd. De tre viktigaste parametrarna för attkom ihåg om fixering är: (1) håll tiden mellan dödande och fixering tillett minimum. (2) Håll vävnadens storlek så liten som möjligt utan att förlorainformation eller förstöra vävnaden. Om ett stort prov måste fixas, behållenen dimension mindre än 1 mm, annars nick områden av provet som kan bediscarded så att fixativet kan tränga in. Effektiv penetration av fixativär ca 0,5 mm för osmium. (3) Håll brutto vävnadsdeformation till ett minimum genom att använda skarpa redskap och hålla manipulering av provet till det minsta nödvändiga.

alla ansträngningar måste göras för att säkerställa att vävnaden hålls fuktig i ett fysiologiskt medium tills i fixativ. Dissekering i fixativburkanvänds om manipulering av provet är tidskrävande. Idealisk storlek på provet. eller mindre (faktisk storlek).

om provet flyter måste det vara nedsänkt. I vissa fall kan detta göras genom att doppa provet i ett vätmedel kort före fixering eller tillsats av ett vätmedel till fixeringslösningen. Om awetting agent läggs till fixativet, försök sedan överföra provet tillfärskt fixativ så snart som möjligt. Eftersom fångad luft ofta är orsaken tillvävnad som flyter i fixativet, kan luft ibland avlägsnas av partiellvakuum. Detta är emellertid ibland skadligt för provet. Den mest mildatillvägagångssättet är helt enkelt att sätta en plugg av Kimwipe under fixativets yta och därigenom fånga provet under fixativlösningens yta.

när provet är fixerat, använd samma injektionsflaska hela tidenberedning. Dekantera (eller pipettera) innehållet i injektionsflaskan före varje byte. Vissa människor föredrar att använda en aspirator för att påskynda denna process. Eftersom vävnad förlorad i aspiratorn är oåterkallelig, skulle nybörjare rådas att inte använda aspiratorn tills de har erfarenhet av hanteringsmaterial.

fixeringsmedel används bäst färskt. Antag att alla fixativär åtminstone mildt fotoaktiva och att alla är känsliga för oxidation imiljön. Av denna anledning hålls fixeringsmedel i kylskåp ellerfrys och värms till rumstemperatur strax före användning. Kommersiellt bereddlösningar packas i kvävgas.

glutaraldehyd är normalt klar och har en sjuklig sötlukt. (Men gå inte ut ur ditt sätt att lukta det eftersom det också är en effektivfixativ som en ånga.) Glutaraldehyd kan brytas ned till glutarsyra som ärljus gulaktig i färg. Glutaraldehydfixering kan ske vid rummettemperatur eller i kylskåp i 2 timmar (för extremt litenmaterial), 6 timmar (standard) eller mer om det behövs. Vissa människor håller materialin GA i veckor till år, och om det försämrar materialet kan nedbrytningen inte vara uppenbar. (Användning av GA som en holdinglösning bör betraktas som en lastresort.)

Osmiumtetroxid är en halmfärgad kristall, som när den blandas med vatten resulterar i en liknande färgad lösning. Det bör endast varaanvänds i en rökhuv. Osmium är extremt dyrt, så varje prov ska användaEndast 1 – 2 ml lösning under fixering. Det är mycket labilt vid rummettemperatur och alla glasvaror som används vid beredningen bör vara syratvättadförst att använda för att avlägsna organiska föreningar som kommer att orsaka dess nedbrytning. Osmiumtetroxid i närvaro av ljus, värme eller organiska material kommer att omvandlas till osmiumdioxid, en svart förening som är ineffektiv vid fixeringmaterial. Använda osmium-och svarta osmiumlösningar ska kasseras i enspeciell avfallsbehållare i rökhuven. Osmiumångor är extremteffektiva vid fixering av slemhinnor och bör betraktas som en fara ILAB. All osmiumfixering bör utföras i kylan i upp till 2 timmar-inte längre.

dehydrering

dehydrering är det kemiska avlägsnandet av vatten frånspecimen. Vanliga dehydratiseringsvätskor är etanol och aceton. Potentialproblemen med uttorkning är krympning av provet, plasmolys och avlägsnande av lösliga komponenter från provet. Dehydrering måste genomförasrelativt snabbt för att förhindra överdriven extraktion av alkohol ochacetonlösliga föreningar, men långsamt nog för att förhindra plasmolys.

extraktion av preparatkomponenter är svår att kontrollera. Kolhydrater med låg molekylvikt är särskilt mottagliga, eftersomkolhydrater är vanligtvis dåligt tvärbundna om de alls följer fixering. Proteiner tenderar att vara tvärbundna av glutaraldehyd under primär fixering ochlipiderna av osmiumtetroxid under sekundär fixering. Kolhydraterna är i huvudsak ofixerade. Kopplat till problemet med extraktion är det avkrympning. Båda problemen är allvarligaste vid låga koncentrationer iuttorkningsserie. I allmänhet är snabb uttorkning bäst av dessa skäl.

med 70% alkohol krymper vävnaden inte längre så mycket, menbörjar härda. Faktum är att förlängda perioder av uttorkning i högrekoncentrationer av alkohol kan göra vävnaden ganska spröd. Om en stopppunkt behövs väljer de flesta histologer 70% till 100% alkohol som ett bra ställeatt sluta för kvällen.

om det finns bevis för plasmolys kan det krävas ytterligare uttorkningssteg (och/eller längre förändringar). Cellmembranibland behåller viss osmotisk aktivitet efter korta fixeringsperioder. Längre fixeringsperioder i glutaraldehyd kan också minska osmotisk känslighet. (Membran är väsentligen okänsliga för osmotiska förändringar efter 48 timmars fixering i glutaraldehyd.) Dålig fixering kommer att motverka problem meduttorkning.

uttorkning vid kyltemperaturer saktar ner processen lite och tenderar att ge viss styvhet till vävnaden. Det kan också minska plasmolysenlite. Växter är mest känsliga för dålig uttorkning, och därför kyldauttorkning föredras för dessa vävnader.

när du byter lösningar, se till att provet inte torkar ut. Därför pipar de flesta arbetare inte botten av flaskan torrmellan förändringar, men lämna lite vätska för att hålla proverna torra. På grundval av relativa volymer är denna återstående lösning obetydlig.

för att blanda alkohollösningar används 95% alkohol eftersom användning av100% skulle vara oöverkomligt dyrt. Att använda 95% alkohol för att görauttorka vätskor kan vara förvirrande även med hjälp av en miniräknare. Därför har histologer utvecklat en genväg för dessa beräkningar: mängden alkohol som behövs beräknas som om du använde 100% (till exempel för att göra cirka 100 ml 70% alkohol,lägger du till 70 ml i en graderad cylinder). Därefter reduceras den slutliga volymen av lösningen med 5%. (I detta exempel tillsätts 25 mlof vatten, vilket gör 95 ml 70% alkohol snarare än 100 ml). Detta är lika exakt som att tillsätta 73,68 ml 95% alkohol som skulle behövas för att göra 100 ml 70% lösning, och det är mycket snabbare.

INFILTRATION

infiltration är ersättning av dehydratiseringsvätskan ellerövergångslösningsmedel med plastharts. När det gäller Epon 812 och Spurr ’ Harsin används förändringar av 1/3 harts, 2/3 harts och 100% harts i följd. Stegen i infiltration är färre eftersom mindre skador görs på exemplaretunder detta stadium. Målet med infiltration är helt enkelt den fullständiga penetrationav harts i provet.

lösningar av harts och spädningsvätska bereds omedelbartföre användning och tillsätts till provflaskan. Avfallshartslösningar kasserasi en speciell behållare i rökhuven. Hartserna kan förvaras i frysenmellan användningarna; de måste dock få värmas ordentligt innan behållaren öppnas, eftersom vatten kondenserar på kallt harts.

användning av långsam rotation hjälper till att penetrera hartset i vävnadsblocket. Kvaliteten på penetrationen kan bedömas först efteravslutning. I allmänhet är en något längre infiltrationsperiod bättre ändålig infiltration.

inbäddning

inbäddning innebär den slutliga positioneringen av vävnadenspecimen i den flytande plasten och dess efterföljande polymerisation. Tre typer av formar används ofta vid inbäddning: (1) små kapslar, som gelatinkapslar eller speciella plastbeemkapslar; (2) platta inbäddningsformar; (3) platträtter. Var och en har sin egen uppsättning fördelar och nackdelar. Inbäddning ärDet avgörande steget för att bestämma orienteringen av sektionering. BEEM ochgelatinkapslar är idealiska när provet inte har någon polaritet, eller när specimen kommer att orientera sig genom gravitation. För partikelprover finns speciella Beemkapslar med branta väggar och en smal spets. Platta inbäddningsformarär att föredra när provet måste orienteras i en viss position iden flytande plasten. Detta gör att exakta kors-och längsgående sektioner kan förberedas och hjälper till att anpassa provet. Den platta skålen är användbar när specimen är stor, när orienteringen av provet är opraktiskt, eller när massiva mängder material skannas för att välja ett prov till sektion. Det lilla plastchipet som innehåller det önskade provet måste sedan sågas ut ur blocket och limmas på en dowel eller Bit gjuten plast för snittning.

identifiering av block är lätt att uppnå ochabsolut nödvändigt. Använd en penna eller skrivmaskin, skriv relevanta data påett litet pappersark eller anteckningkort för att sätta in i kapseln eller mögelninnan inbäddning. Med kapslar är följande orienteringar användbara:

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.